Жить флуоресценции метод визуализации количественного пополнения и мобилизации конкретных синаптических везикул (SV) бассейны в центральных нервных окончаний описано. Два раунда С. В. переработки контролируются в той же нервных окончаний обеспечения внутреннего контроля.
After neurotransmitter release in central nerve terminals, SVs are rapidly retrieved by endocytosis. Retrieved SVs are then refilled with neurotransmitter and rejoin the recycling pool, defined as SVs that are available for exocytosis1,2. The recycling pool can generally be subdivided into two distinct pools – the readily releasable pool (RRP) and the reserve pool (RP). As their names imply, the RRP consists of SVs that are immediately available for fusion while RP SVs are released only during intense stimulation1,2. It is important to have a reliable assay that reports the differential replenishment of these SV pools in order to understand 1) how SVs traffic after different modes of endocytosis (such as clathrin-dependent endocytosis and activity-dependent bulk endocytosis) and 2) the mechanisms controlling the mobilisation of both the RRP and RP in response to different stimuli.
FM dyes are routinely employed to quantitatively report SV turnover in central nerve terminals3-8. They have a hydrophobic hydrocarbon tail that allows reversible partitioning in the lipid bilayer, and a hydrophilic head group that blocks passage across membranes. The dyes have little fluorescence in aqueous solution, but their quantum yield increases dramatically when partitioned in membrane9. Thus FM dyes are ideal fluorescent probes for tracking actively recycling SVs. The standard protocol for use of FM dye is as follows. First they are applied to neurons and are taken up during endocytosis (Figure 1). After non-internalised dye is washed away from the plasma membrane, recycled SVs redistribute within the recycling pool. These SVs are then depleted using unloading stimuli (Figure 1). Since FM dye labelling of SVs is quantal10, the resulting fluorescence drop is proportional to the amount of vesicles released. Thus, the recycling and fusion of SVs generated from the previous round of endocytosis can be reliably quantified.
Here, we present a protocol that has been modified to obtain two additional elements of information. Firstly, sequential unloading stimuli are used to differentially unload the RRP and the RP, to allow quantification of the replenishment of specific SV pools. Secondly, each nerve terminal undergoes the protocol twice. Thus, the response of the same nerve terminal at S1 can be compared against the presence of a test substance at phase S2 (Figure 2), providing an internal control. This is important, since the extent of SV recycling across different nerve terminals is highly variable11.
Any adherent primary neuronal cultures may be used for this protocol, however the plating density, solutions and stimulation conditions are optimised for cerebellar granule neurons (CGNs)12,13.
FM красители широко используются для исследования функции нервов терминала во многих нейронов препаратов. Они были использованы главным образом для контроля степени либо эндоцитоза С. В., С. В. оборота или кинетики экзоцитоза 6. Описанные протокол расширяет эти исследования для изучения дифференциальных разгрузке конкретных С. В. бассейнов. Это дает дополнительную информацию о пополнении С. В. бассейнов, а также их степень мобилизации.
FM-красители могут быть использованы для обозначения нескольких раундов С. В. переработки в пределах одного нервных окончаний. Мы использовали это свойство и предназначен протоколы, в которых С. В. оборот каждого терминала можно контролировать два раза в том же нервных окончаний. Это обеспечивает точный внутренний контроль, который необходим из-за неоднородного характера утилизации SV параллельно нервных окончаний 11. Через использование S1 фазы внутреннего контроля, заправки РРП, РП и общегоС. В. бассейн в наличии препараты могут быть надежно и напрямую сравнивать.
В дополнение к предоставлению информации абсолютный размер утилизации, РРП и RP бассейны в различных условиях стимуляции, этот протокол также может предоставить данные в следующих – 1) Разделение спутников между РРП и РП в зависимости от переработки бассейн S1 и S2, 2) относительный размер S2 бассейнов (RRP и RP) в зависимости от общего числа S1 бассейн утилизации и 3) относительный размер какой-либо определенной С. В. бассейн в S2 в зависимости от одного пула в S1. Данный протокол не будет предоставлять информацию о разгрузке кинетики однако, так как время сбора данных слишком медленная (для кинетических измерений приобретения раз должно быть как можно быстрее и разгрузки автоматически синхронизированы с захвата изображения).
Наш 30 Гц 2 с стимулами вызывает идентичные степени RRP разгрузки гипертонической сахарозы 8. Поскольку размер оправыопределяется гипертонической сахарозы разгрузки 15, мы можем констатировать, что этот протокол выгружает все RRP спутников, в согласии с исследованиями в нейронах гиппокампа 16. Резервного пула почти полностью истощены три поезда из 400 стимулов (40 Гц 10 с каждого), так как это стимуляция выгружает одинаковое количество красителя парадигмы (2 стимулы с 50 мМ KCl), которые истощают 95% всех красителей меченных спутников 8,17. Точная количественная оценка размера и РРП и резервный пул также зависит от получения информации в линейный динамический диапазон ПЗС-камерой.
Это простой протокол также может быть изменена в дальнейшем. Сила загрузки стимулы также могут быть разнообразны, чтобы определить, каким образом активность нейронов и различные режимы эндоцитоза влияют С. В. бассейн пополнения. Кроме того, более двух циклов погрузки и разгрузки могут быть выполнены, если потребуется. Этот протокол также может быть использован в клетках, трансфицированных либо гиперэкспрессия илиshRNA векторов. Из-за низкой эффективности трансфекции первичных нейронов культур, выраженная белки должны быть помечены флуоресцентным белкам. Важно, чтобы эти флуоресцентные метки не мешали FM сигнала красителя (использование голубого или красного белков, например). В этом случае, нервные окончания от трансфицированных и не трансфекции клеток в одном поле зрения, можно также сопоставить в качестве дополнительного контроля 8. В таких экспериментах сравнение степени загрузки между S1 и S2 нагрузки не имеет большого значения, так как возмущения присутствует как во время нагрузок. Разбиение красителя между бассейнами С. В. все еще может быть визуализированы Однако 8.
Генетические журналистам называется pHluorins также может быть использован для контроля С. В. экзоцитоз и эндоцитоз в первичных нейронов культуры. Эти зонды использование рН-чувствительных зеленого флуоресцентного белка рН среды просвета области С. В. меченых белков, таких как VAMP, synaptophysin и VGLUT1 18 </suр>. При использовании в сочетании с ингибиторами везикулярного АТФазы, pHluorins могут сообщать как на кинетику и степень мобилизации С. В. бассейн 19. FM-чернила на основе красителя Описанный здесь подход имеет некоторые преимущества по сравнению с техникой pHluorin, во-первых, FM красителей предоставить информацию о которых С. В. эндоцитоза режиме пополняется РРП и резервные бассейны 8. Во-вторых конкретные С. В. бассейны могут быть помечены FM красителей, которые имеют различные спектральные свойства 20 и, наконец, не существует никаких требований для трансфекции. FM красители не могут предоставить информацию о С. В. трафика между отдыха и переработки С. В. бассейны однако (в отличие от pHluorins 19), так как по определению спутников должны быть загружены с красителем во время эндоцитоза, чтобы быть видимыми. Таким образом, оба FM красителей и pHluorins имеют сильные и слабые стороны и наиболее эффективны, когда используются в независимых экспериментах на адрес тот же вопрос.
Изображения высокого качества имеют важное значение для анализа и действительным reproducibле результаты. Хотя горизонтального дрейфа может быть легко исправлена, экспериментов, где есть дрейф в Z-оси, не могут быть восстановлены. По этой причине важно, чтобы переориентировать изображений до начала S1 и S2 разгружается. В случаях, когда значительная флуоресцентные распад произошел, распад поправки могут быть применены (как правило, путем вычитания ранее записанный след от FM-загруженных клеток в отсутствие стимуляции). Тем не менее, предполагается, что распад коррекция выполняется только для графического представления и не должны использоваться для любого количественного анализа.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантом Wellcome Trust (Ref: 084277).
Name | Company | Catalogue no. |
---|---|---|
AxioCam MRm Rev. 3 Digital Camera | Carl Zeiss | 4265099901000 |
Axio Observer.A1 Microscope | Carl Zeiss | 4310040000000 |
Cell culture plates (6 wells) | Greiner bio-one | 657160 |
Centrifuge (Universal 32R) | Hettich Zentrifugen | 1610 |
CO2 incubator | Heraeus Instruments | 51014042 |
Falcon tubes (15/50 ml) | Greiner bio-one | 188271/210261 |
Fluar 20X /0.75 ∞/0.17 Objective | Carl Zeiss | 4401459901000 |
Glass coverslips (Ø25mm) | VWR international | 631-1584 |
Glass pasteur pipettes (230 nm) | Greiner bio-one | 612-1799 |
Haemocytometer | VWR | 15170-170 |
Imaging chamber | Warner | RC-21 BRFS |
Laminar flow hood | BIOHIT | VLF BHS 1200 |
McIlwain Tissue Chopper | Mickle Laboratory Engineering Co. Ltd. | MTC/2 |
Mercury lamp | Carl Zeiss | HBO 103 |
MultiStim System Electrical Stimulator (100mV, 1ms pluse width) | Digitimer Ltd. | D330 |
Perfusion pump | Watson-Marlow | 313S |
Serological Pipettes (5/10/25 ml) | Greiner bio-one | 606180/607180/760180 |
Shutter controller | Carl Zeiss | MAC5000 |
Syringe (20 ml) | BD Plastipak | ST01-B002 |
Syringe Filters (Minisart – 0.20 μm) | Sartorius Stedim | 16532 |
VC-6 Six Channel valve controller | Warner | 64-0135 |
YFP Filter set (Set 46) | Carl Zeiss | 1196-681 |
Table 1. Specific equipment and apparatus used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
FM1-43 | Cambridge BioScience | BT70021 | 10 μM |
FM2-10 | Cambridge BioScience | BT70044 | 100 μM |
Poly-D-lysine | Sigma | P7886 | 15 μg/ml |
Silicone grease | Sigma | 85403 | – |
Table 2. Specific reagents used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | 0.3% |
D-Glucose | Sigma | G5767 | 0.25% |
MgSO4·7H2O | Sigma | M2773 | 1.5 mM |
D-PBS | Gibco | 21300 | 960 mg/100 ml |
-make 100ml fresh for each preparation
-sterile filter before use
Table 3. Solution B for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Solution B | – | – | 19 ml |
Trypsin (5 mg/ml stock, -20°C) | Sigma | T9201 | 1 ml |
Table 4. Solution T for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Solution C | – | – | 3.2 ml |
Solution B | – | – | 16.8 ml |
Table 5. Solution W for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Deoxyribonuclease (DNase, 500 U per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma | D5025 | 0.5 ml |
MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | 1.5 mM |
Solution B | – | – | 10 ml |
Soybean trypsin inhibitor (SBTI, 0.5 mg per 0.5 ml stock, -20°C) | Sigma | T9003 | 0.5 ml |
Table 6. Solution C for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | 4% |
Earle’s Balanced Salt Solution (EBSS) | Gibco | 24010 | 10 ml |
MgSO4· 7H2O | Sigma | M2773 | 3 mM |
Table 7. EBSS Solution for CGN preparation
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
Cytosine β-D-arabinofuranoside (Ara-C) * | Sigma | C1768 | 10 μM |
Foetal Bovine Serum | Gibco | 10106 | 10 % |
D-Glucose | Sigma | G5767 | 30 mM |
L-Glutamine | Sigma | G3126 | 2 mM |
KCl | Sigma | P5405 | 25 mM |
Minimal Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090 | 500 ml |
Penicillin (P)/Streptomycin (S) | Gibco | 15140 | 100 U/ml (P), 100 μg/ml (S) |
*Ara-C should be added to medium from 1 DIV onwards
Table 8. Culture Media for CGN preparation
Name | Version | Company |
---|---|---|
AxioVision Rel. | 4.8 | Carl Zeiss |
ImageJ | 1.42q | National Institutes of Health |
Microsoft Excel | 2003 | Microsoft |
Table 9. Specific computer software used
Name | Company | Catalogue no. | Concentration |
---|---|---|---|
CaCl2 · 2H2O | Sigma | C7902 | 1.3 mM |
Glucose | Sigma | G5767 | 5 mM |
KCl | Sigma | P5405 | 3.5 mM |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | 0.4 mM |
MgCl2·6H2O | Sigma | M0250 | 1.2 mM |
NaCl | Fluka | 71378 | 170 mM |
NaHCO3 | Fluka | 71627 | 5 mM |
Na2SO4 | BDH Laboratory Supplies | 10264 | 1.2 mM |
TES | Sigma | T1375 | 20 mM |
Table 10. Saline Solution (pH 7.4)