إعداد الحمض النووي الفيروسي من Nucleocapsids
Summary
نحن تصف عملية عزل الحمض النووي عالية النقاء هربس nucleocapsid من الخلايا المصابة. القبض على الحمض النووي النهائي من الحل هو تركيز عالية ونقاء ، مما يجعله مثاليا للالتسلسل عالية الإنتاجية ، وارتفاع الإخلاص تفاعلات PCR ، وtransfections لإنتاج recombinants الفيروسية الجديدة.
Abstract
الفيروسات هي طفيليات تلزم الخلوية ، وبالتالي فإن دراسة عينات من الحمض النووي الفيروسي يتطلب عزل المواد بعيدا عن الملوثات الخلية المضيفة والحمض النووي. تطبيقات المصب عدة تتطلب كميات كبيرة من الحمض النووي الفيروسي النقي ، والتي يتم توفيرها من قبل هذا البروتوكول. وتشمل هذه التطبيقات تسلسل الجينوم الفيروسي ، حيث إزالة الحمض النووي المضيف أمر حاسم لتحسين بيانات الناتج عن تسلسل الفيروسي ، وإنتاج سلالات جديدة المؤتلف الفيروسية ، حيث شارك في 1،2 ترنسفكأيشن تنقيته من الحمض النووي الفيروسي البلازميد ويسهل إعادة التركيب الخطي. ، 3
هذا الإجراء يستخدم مزيجا من عمليات الاستخراج وكثافة المستندة الطرد المركزي لعزل الحمض النووي المنقى خطية هربس nucleocapsid من الخلايا المصابة. 4،5 الخطوات الأولية تهدف إلى تنقية عزل الفيروسية capsids المنقى ، والتي تحتوي على الحمض النووي الفيروسي حماية خلال عمليات الاستخراج والخطوات الطرد المركزي التي تعمل على إزالة البروتينات والحمض النووي الخلوي. تحلل من النشرات nucleocapsids ثم الحمض النووي الفيروسي ، واثنين النهائي الفينول كلوروفورم خطوات إزالة البروتينات المتبقية. القبض على الحمض النووي النهائي من الحل يتركز عالية ونقية ، مع 260/280 OD 1.90 متوسط. اعتمادا على كمية من الخلايا المصابة المستخدمة ، غلة مجموعة الحمض النووي الفيروسي 150-800 ميكروغرام أو أكثر. نقاء من هذا الحمض النووي يجعلها مستقرة خلال التخزين الطويل الأجل في 4C. وبالتالي هذا الحمض النووي مناسبة بشكل مثالي لسرعة عالية التسلسل عالية الدقة تفاعلات PCR ، وtransfections.
قبل بداية البروتوكول ، فمن المهم أن نعرف أن متوسط عدد الخلايا في الطبق (على سبيل المثال ما معدله 8 × 10 خلايا PK – 15 6 متكدسة في صحن 15 سم) لاستخدامها ، وعيار من المخزون الفيروسي ( مثال 1 × 10 8 البلاك تشكيل وحدات لكل مل). هذه ضرورية لحساب تعدد المناسب للعدوى (وزارة الداخلية) للبروتوكول. 6 وعلى سبيل المثال ، لتصيب طبق واحد من 15 سم PK – 15 مع الخلايا الفيروسية الأسهم في أعلاه ، في وزارة الداخلية من 5 ، يمكنك استخدام ميكرولتر من 400 الأسهم الفيروسية وتمييع مع 3.6 مل من المتوسط (إجمالي حجم تلقيح لمدة 4 مل صفيحة 15 سم).
يمكن إعداد التحضيرات متعددة الحمض النووي الفيروسي في نفس الوقت. ويقتصر عدد التحضيرات في وقت واحد فقط من قبل عدد من الأنابيب التي عقدها الدوار نابذة فائقة السرعة (واحدة لكل فيروس ، انظر الخطوة 3.9 أدناه). نحن هنا وصف الإجراء كما لو يجري لأحد الفيروسات.
Protocol
Discussion
وقد وضعت أصلا أجزاء من هذا البروتوكول لعزل الحمض النووي الفيروسي في BSL4 الظروف ، لكنه يتكيف بشكل جيد على قدم المساواة لغير BSL شروطه. 4 ونحن عادة ما تستخدم هذا البروتوكول لعزل الحمض النووي من PRV ألفا herpesviruses وHSV – 1 ، التي الجينوم الحمض النووي المغلقة في قفيصة البروتي…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب نقدر مساهمات سميث جريج ، بوميرانز ليزا ، ليمان مات ، إلدريدج مارليس ، Halina Goraczniak Staniszewska ، وأعضاء في مختبر Enquist هذا البروتوكول صقل.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Freon (1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoroethane) | Fisher | T178-4 | Check with your institution for guidelines on appropriate disposal of Freon-containing waste, or see Mendez et al. for potential Freon alternatives.9 |
| Phase lock gel tubes, Heavy 15ml capacity | 5 PRIME | 2302850 | Optional |
| Polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman* | 331372* | *Select tubes appropriate for your own ultracentrifuge; these are included as an example only |
| NP-40 / IGEPAL | Sigma | I-3021 | |
| PK-15 cells | ATCC | CCL-33 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 | |
| PBS | HyClone | SH30028.03 |
Riferimenti
- Szpara, M. L., Parsons, L., Enquist, L. W. Sequence variability in clinical and laboratory isolates of herpes simplex virus 1 reveals new mutations. J Virol. 84, 5303-5313 (2010).
- Banfield, B. W., Kaufman, J. D., Randall, J. A., Pickard, G. E. Development of pseudorabies virus strains expressing red fluorescent proteins: new tools for multisynaptic labeling applications. J Virol. 77, 10106-10112 (2003).
- Kobiler, O., Lipman, Y., Therkelsen, K., Daubechies, I., Enquist, L. W. Herpesviruses carrying a Brainbow cassette reveal replication and expression of limited numbers of incoming genomes. Nat Commun. 1, 146-146 (2010).
- Enquist, L. W., Madden, M. J., Schiop-Stanley, P., Vande Woude, G. F. Cloning of herpes simplex type 1 DNA fragments in a bacteriophage lambda vector. Science. 203, 541-544 (1979).
- Smith, G. A., Enquist, L. W. Construction and transposon mutagenesis in Escherichia coli of a full-length infectious clone of pseudorabies virus, an alphaherpesvirus. J Virol. 73, 6405-6414 (1999).
- Flint, S. J., Enquist, L. W., Racaniello, V. R., Skalka, A. M. . Principles of virology. , (2008).
- Pomeranz, L. E., Reynolds, A. E., Hengartner, C. J. Molecular biology of pseudorabies virus: impact on neurovirology and veterinary medicine. Microbiol Mol Biol Rev. 69, 462-500 (2005).
- Roizman, B., Pellett, P. E., Knipe, D. M., Howley, P. M. . Fields Virology. , 2381-2397 (2001).
- Mendez, I. I., Hermann, L. L., Hazelton, P. R., Coombs, K. M. A comparative analysis of freon substitutes in the purification of reovirus and calicivirus. J Virol Methods. 90, 59-67 (2000).
- Gharabaghi, F., Aymard, M., Trotemann, P., Gerdil, C. A rapid and simplified micromethod for subtyping varicella-zoster virus. J Med Virol. 31, 129-134 (1990).
- Granstedt, A. E., Szpara, M. L., Kuhn, B., Wang, S. S., Enquist, L. W. Fluorescence-based monitoring of in vivo neural activity using a circuit-tracing pseudorabies virus. PLoS One. 4, e6923-e6923 (2009).
