Estrazione di DNA virale da nucleocapsidi

Sommario

Noi descriviamo il processo di isolamento del DNA ad alta herpesvirus nucleocapside purezza dalle cellule infette. Il DNA finale catturato dalla soluzione è di alta concentrazione e purezza, rendendolo ideale per high-throughput sequencing, l'alta fedeltà reazioni di PCR, e trasfezioni per produrre nuovi ricombinanti virali.

Abstract

I virus sono parassiti obbligati cellulare, e quindi lo studio del loro DNA virale richiede materiale isolante lontano da agenti inquinanti e del DNA della cellula ospite. Diverse applicazioni a valle richiedono grandi quantità di puro DNA virale, che viene fornito da questo protocollo. Queste applicazioni includono il sequenziamento del genoma virale, in cui la rimozione del DNA ospite è fondamentale per ottimizzare l'output dei dati per le sequenze virali, e la produzione di nuovi ceppi virali ricombinanti, in cui la co-trasfezione del plasmide purificato e lineare facilita la ricombinazione del DNA virale. ^{1,2, 3}

Questa procedura utilizza una combinazione di estrazioni e la densità a base di centrifugazione per isolare il DNA purificato lineare herpesvirus nucleocapside dalle cellule infette. ^4,5 Le fasi iniziali di purificazione scopo di isolare purificata capsidi virale, che contengono e proteggono il DNA virale durante le estrazioni e le fasi di centrifugazione che rimuovono le proteine ​​cellulari e il DNA. Lisi delle nucleocapsidi quindi rilascia DNA virale, e due finali fenolo-cloroformio passi rimuovere le proteine ​​rimanenti. Il DNA finale catturato da una soluzione è altamente concentrato e puro, con un valore medio di 1,90 _260/280. A seconda della quantità di cellule infette utilizzati, i rendimenti della gamma DNA virale 150-800 mg o più. La purezza di questo DNA rende stabile durante conservazione a lungo termine a 4C. Questo DNA è quindi ideale per high-throughput sequencing, l'alta fedeltà reazioni di PCR, e trasfezioni.

Prima di iniziare la procedura, è importante conoscere il numero medio di cellule per piatto (ad esempio una media di 8 x 10 ⁶ PK-15 cellule in un piatto confluenti 15 cm), e il titolo dello stock virale da utilizzare ( ad esempio, 1 x 10 ⁸ unità formanti placca per ml). Queste sono necessarie per calcolare la molteplicità appropriata di infezione (MOI) per il protocollo. ⁶ Per esempio, per infettare piatto da 15 cm di PK-15 celle con il brodo sopra virale, ad una MOI di 5, si usa 400 ml di magazzino virale e diluire con 3,6 ml di terreno (volume inoculazione totale di 4 ml per piastra da 15 cm).

Molteplici preparazioni di DNA virale può essere preparato allo stesso tempo. Il numero di preparati simultanea è limitata solo dal numero di tubi detenuta dal rotore ultracentrifuga (uno per ogni virus; vedi punto 3.9). Qui si descrive la procedura come se venisse fatto per un virus.

Protocollo

1. Primo Giorno: Infezione virale e preparazione del buffer

1. Preparare piatti 50-10 (15 cm di diametro) di cellule di coltura per le infezioni, ad esempio, PK-15 cellule per virus pseudorabbia (PRV) o cellule Vero per l'herpes simplex virus (HSV).
2. Quando le cellule sono 95 - confluenti al 100%, li infettano a (MOI) di 5-10. Per fare questo, inoculare ciascuna piastra con magazzino virus in un volume totale di 4 ml per piastra, incubare le piastre per 1 ora a 37 ° C. Placche di roccia dolcemente ogni 15 minuti per assicurarsi che il monostrato cellulare rimane completamente rivestito con l'inoculo del virus. Nel frattempo, scaldare la media per il ....

Discussione

Parti di questo protocollo sono stati originariamente sviluppati per l'isolamento del DNA virale nel BSL4 condizioni, ma si adatta altrettanto bene a non BSL condizioni. ⁴ Si comunemente utilizzano questo protocollo per isolare il DNA dalla alfa-herpesvirus PRV e HSV-1, che hanno genomi di DNA racchiuso in una capside proteica e circondato da un involucro lipidico. ^7,8 Tuttavia è probabile direttamente adattabile ad altri virus a DNA di grandi dimensioni, tra cui beta-e gamma-herpes virus e gli.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Freon (1,1,2-tricloro-1 ,2,2-trifluoroetano)	Pescatore	T178-4	Chiedi al tuo istituto per le linee guida sullo smaltimento appropriato dei rifiuti contenenti freon, o vedere Mendez et al. alternative Freon potenziale 9.
Fase di bloccaggio tubi di gel, Heavy capacità di 15 ml	5 PRIME	2302850	Opzionale
Polyallomer ultracentrifuga tubi	Beckman *	331372 *	* Tubi Seleziona appropriato per il proprio ultracentrifuga; questi sono inclusi come esempio solo
NP-40 / IGEPAL	Sigma	I-3021
PK-15 cellule	ATCC	CCL-33
Cellule Vero	ATCC	CCL-81
PBS	Hyclone	SH30028.03