Preparación de ADN viral de nucleocápside

Summary

Se describe el proceso de aislamiento de ADN de alta pureza herpesvirus nucleocápside de las células infectadas. El final de ADN capturado de la solución es de alta concentración y pureza, por lo que es ideal para la secuenciación de alto rendimiento, alta fidelidad de las reacciones de PCR, y transfecciones para producir nuevas recombinaciones virales.

Abstract

Los virus son parásitos obligados celular, y por lo tanto el estudio de su ADN requiere aislar material viral de distancia de los contaminantes de la célula huésped y el ADN. Varias aplicaciones posteriores requieren grandes cantidades de ADN viral pura, que es proporcionada por este protocolo. Estas aplicaciones incluyen la secuenciación del genoma viral, donde la extracción de ADN del huésped es crucial para optimizar la salida de datos de secuencias virales, y la producción de nuevas cepas virales recombinantes, ^1,2, donde la co-transfección de ADN purificado viral y plásmido lineal facilita la ^{recombinación., 3}

Este procedimiento utiliza una combinación de extracción y la densidad basado en la centrifugación para aislar ADN purificado herpesvirus nucleocápside lineal de las células infectadas. ^4,5 Los pasos de la purificación inicial objetivo de aislar a cápsidas virales purificados, que contienen y protegen el ADN viral en las extracciones y los pasos de centrifugación que eliminan las proteínas celulares y el ADN. Lisis de la nucleocápside libera el ADN viral, y dos finales de fenol-cloroformo pasos eliminar las proteínas restantes. El final de ADN capturado de la solución está muy concentrado y puro, con un promedio de _260/280 OD de 1,90. Dependiendo de la cantidad de células infectadas, los rendimientos de la gama de ADN viral 150 a 800 mg o más. La pureza de este ADN hace que sea estable durante el almacenamiento a largo plazo a 4 ° C. Este ADN es por lo tanto ideal para el alto rendimiento de secuenciación de alta fidelidad de las reacciones de PCR, y transfección.

Antes de comenzar el protocolo, es importante conocer el número promedio de células por plato (por ejemplo, un promedio de 8 x 10 ⁶ células PK-15 en un plato cm confluentes 15), y el título de la acción viral para ser utilizado ( por ejemplo, 1 x 10 ⁸ unidades formadoras de placas por ml). Estos son necesarios para calcular la multiplicidad apropiado de la infección (MOI) para el protocolo. ⁶ Por ejemplo, para infectar a un plato de 15 cm de células PK-15 con la acción viral por encima, en una MOI de 5, se utiliza 400 l de stock viral y la mezclan con 3,6 ml de medio (volumen de inoculación total de 4 ml para una placa de 15 cm).

Múltiples preparaciones de ADN viral se puede preparar al mismo tiempo. El número de preparaciones simultáneas está limitado sólo por el número de tubos en poder del rotor ultracentrífuga (uno por virus, consulte el paso 3.9 más adelante). A continuación se describe el procedimiento como si se hace por un virus.

Protocol

1. Primer Día: infección viral y preparación de tampones Preparar platos 50-10 (15 cm de diámetro) de las células de cultivo de tejidos para la infección, por ejemplo, células PK-15 para el virus de la pseudorrabia (PRV) o de células Vero de virus del herpes simple (VHS). Cuando las células son de 95 – 100% confluentes, que infectan a un (MOI) de 5.10. Para ello, vacunar a cada plato con stock de virus en un volumen total de 4 ml por placa, y luego se incuban las placas durante 1 hora a 37 …

Discussion

Algunas partes de este protocolo fueron desarrollados originalmente para el aislamiento de ADN viral en BSL4 condiciones, pero se adapta igualmente bien a los no-BSL condiciones. ⁴ Se suelen usar este protocolo para aislar el ADN de la PRV alfa-herpesvirus y el VHS-1, que tienen genomas de ADN encerrado en una cápside proteica y rodeado por una envoltura lipídica. ^7,8 Sin embargo, es probable que directamente adaptables a otras grandes virus de ADN, incluyendo beta-y gamma-herpesvirus y adenoviru…

Materials

Name of reagent	Company	Catalogue number	Comments
Freon (1,1,2-trichloro-1,2,2-trifluoroethane)	Fisher	T178-4	Check with your institution for guidelines on appropriate disposal of Freon-containing waste, or see Mendez et al. for potential Freon alternatives.9
Phase lock gel tubes, Heavy 15ml capacity	5 PRIME	2302850	Optional
Polyallomer ultracentrifuge tubes	Beckman*	331372*	*Select tubes appropriate for your own ultracentrifuge; these are included as an example only
NP-40 / IGEPAL	Sigma	I-3021
PK-15 cells	ATCC	CCL-33
Vero cells	ATCC	CCL-81
PBS	HyClone	SH30028.03