A Simple Guide Schroef Methode voor Intracraniële xenograft Studies in Muizen

Summary

Met het oog op nieuwe therapeutische paradigma's voor de behandeling van gliomen te evalueren, fysiologisch relevante modellen zijn essentieel. We maken gebruik van een implanteerbare gids schroef procedure voor de oprichting van intracraniale xenotransplantaatmodellen dat is sneller en veiliger dan stereotactische benaderingen.

Abstract

Het enten van menselijke tumorcellen in de hersenen van muizen immunosuppressie is een gevestigde methode voor de studie van de hersenen kanker inclusief glioblastoma (glioom) en medulloblastoom. De meest gebruikte stereotactische aanpak alleen toestaat voor de injectie van een enkel dier in een tijd, is arbeidsintensief en vereist zeer gespecialiseerde apparatuur. De gids schroef methode, oorspronkelijk ontwikkeld door Lal et al.., ¹ werd ontwikkeld om omslachtige stereotactische procedures te elimineren. We hebben nu beschrijven een aangepaste gids schroef aanpak die is snel en uitzonderlijk veilig, die beide een kritische, ethische overwegingen. Met name onze werkwijze omvat nu een infusiepomp waarmee maximaal 10 dieren tegelijk worden geïnjecteerd met tumorcellen.

Om aan te tonen het nut van deze procedure, wij menselijke U87MG glioomcellen opgericht als intracraniële xenotransplantaten in muizen, die vervolgens werden behandeld met AMG102, een volledig humaan antilichaam gericht op HGF / verstrooien factor ondergaat momenteel klinische evaluatie ^2-5. Systemische injectie van AMG102 verlengde significant de overleving van alle muizen met intracraniële U87MG xenografts en resulteerde in een aantal volledige genezing.

Deze studie toont aan dat de gids schroef-methode is een goedkope, zeer reproduceerbaar aanpak voor het vaststellen van intracraniële xenotransplantaten. Bovendien biedt een relevante fysiologische model voor de validatie van nieuwe therapeutische strategieën voor de behandeling van hersentumoren.

Protocol

1. Cellijnen U87MG glioma cellen worden gekweekt in grote weefselkweek kolven met DMEM-F12 aangevuld met 5% foetaal bovine serum (FBS). Cellen worden geoogst door het wassen kolven tweemaal met warm fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en incuberen ze op 37 ° C gedurende 5 minuten met 10 ml PBS, met 0,25% trypsine en 0,05% EDTA. Zodra cellen zijn opgeheven, zijn ze geplaatst in een 50 ml buis met 10 ml van de cultuur media en gecentrifugeerd (300 X g voor 4 min). Na het wassen, worden de cellen geresuspendeerd bij een concentratie van 10 x 10 6 / ml in cultuur media, waardoor voor een inenting van 50.000 cellen / ul 5. Cellen worden bewaard op ijs tot intracraniële injectie. 2. Gids schroef intracraniële bouten Deze procedure kan worden uitgevoerd enkele dagen voorafgaand aan de injectie van de cellen. Alle hier beschreven procedures zijn uitgevoerd onder strikte steriele omstandigheden. Muizen (BALB / c nu / nu vrouw, 5-6 weken, ongeveer 18 g) zijn genummerd voor identificatiedoeleinden, gewogen en onder narcose met een intraperitoneale (IP) injectie van een mengsel van ketamine (100 mg / kg) en xylazine (5 mg / kg). De huid wordt afgeveegd neer met een jodium-oplossing en een kleine incisie (2-3 mm) is gemaakt langs de rechterkant van de middellijn en anterior naar de interaurale lijn. Dit onthult de coronale en sagittale hechtingen van de schedel. De bregma is geplaatst op de kruising van deze twee hechtingen. De gids schroef entry point is dan gemarkeerd op een punt 2,5 mm lateraal en 1 mm juist voor de bregma. Dit punt bevindt zich direct boven de nucleus caudatus 1. A 1 x 1 mm diep gat is geboord met een steriele hand gehouden spiraalboor door de schedel naar de dura. Een gesteriliseerde gids schroef die 1,6 mm verlengt onder het oppervlak van schedels in de dura wordt dan vastgeschroefd in het gat met een schroevendraaier tot gelijk met de schedel (figuur 1a). Een steriele stilet of schroef dummy wordt dan geplaatst in het centrale gat van de gids schroef aan de opening (Figuur 1B) te sluiten. De wond wordt gesloten met Vetbond Tissue Adhesive (n-butyl cyanoacrylaat) en de muizen krijgen een intraperitoneale injectie van reversine (kleine dieren) (0,1 ml / kg) en carprofen (5 mg/kg/100 ul) voor pijnstilling. Muizen worden dan toegestaan ​​om terug op een warming mat (36 ° C), die kan oplopen tot 20 minuten. Muizen worden vaak gecontroleerd en waargenomen tijdens deze herstelperiode tot ze volledig bij bewustzijn. 3. Intracraniële cellulaire aanslaan Een steriele geboeid Hamilton spuit wordt bereid door het aanbrengen van een klein plastic ring om de naald zodat alleen 2 mm van de naald uit te breiden onder de gids schroef uitlaat (Figuur 1B). De laatste inoculatie punt is dan ook 3,5 mm onder de schedel oppervlak. Vier dagen na de gids schroef operatie, de muizen weer verdoofd als hierboven (2.1) en een kleine incisie wordt gemaakt over de gids schroef om de stilet verwijderen. De geboeid Hamilton spuit is vervolgens gevuld met 5 pi van goed gemengd cellen die voorzorg niet te maken of op te stellen eventuele luchtbellen. De spuit is bevestigd aan de perfusie pomp en de naald wordt ingebracht in de gids schroef (figuur 1C). De cellen worden vervolgens toegediend met een snelheid van 30 ul per uur. De geautomatiseerde apparatuur (figuur 1D) liet ons toe om maximaal te injecteren tot 10 dieren in een tijd op een constant debiet. Cellen kunnen ook handmatig worden geïnjecteerd met behulp van de handboeien hamilton spuit of als alternatief de spuit kan worden geboeid door een 200 ul pipettip die is gegarneerd met 3 mm, zodat de naald tot voorbij de gids schroef uit te breiden met 2 mm. De injectie moet dan worden uitgevoerd bij een constante gestaag tempo. Wanneer infusie is voltooid, is de spuit zorgvuldig verwijderd en de stilet wordt vervangen in de gids schroef. De wond is gelijmd gesloten en de muizen worden gegeven herstel van medicijnen als voorheen (2.7) en om te herstellen op een warming mat. 4. Therapeutische uitdaging Vier dagen na de inoculatie U87MG cel, zijn muizen gewogen en willekeurig verdeeld in controle en behandeling van groepen. De controle groep krijgt een intra-peritoneale (IP) injectie van PBS (100 pl), terwijl de behandelde groep krijgt een IP-injectie van AMG102 (100 ug in 100 ul PBS). Injecties worden herhaald om de tweede dag gedurende 14 dagen, in totaal 6 injecties (figuur 2). Na de laatste injectie, zijn muizen dagelijks gecontroleerd en gewogen om de dag. Als muizen begon te significante neurologische disfuncties (evenwicht stoornis, verlamming), uitdroging, of meer dan 10% gewichtsverlies of stervende weer te geven, werden ze humaan afgemaakt. Deze humane eindpunt dag werden vervolgens opgenomen op de Kaplan-Meier survival curve. 5. Evaluatie van de therapeutische efficiëntie </p> De Kaplan-Meier survival curve werd gegenereerd met behulp van GraphPad Prism 4.03 voor Windows; GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com 3. Sterfgevallen of euthanizations werden gemarkeerd als eindpunt gebeurtenissen en scoorde als 1. Dieren die in leven bleef op het einde van het experiment werden geregistreerd als niet-events en scoorde als 0. 6. Representatieve resultaten: Controle dieren begon te tekenen van neurologische verstoring en gewichtsverlies 23 dagen zien na de eerste inoculatie van cellen. Dit was significant vertraagd in de AMG102 behandelde groep tot 35 dagen. Inderdaad door de dagen 35, 77% (n = 7 / 9) van de controle groep was ingeslapen. De Kaplan-Meier survival curve toont duidelijk de sterke toename in overleving in reactie op AMG102 behandeling (figuur 3). Per dag 70, had 88% van de controle muizen zijn gedood (n = 8 / 9) in vergelijking met 37% (n = 3 / 8) van AMG102 behandelde groep. Histologische analyse van de hersenen bevestigd dat alle 9 dieren in de controlegroep ontwikkelden tumoren in vergelijking met slechts 3 van de 8 AMG102 behandelde muizen (figuur 4). Figuur 1: Image (A) laat zien intracraniële gids schroef geplaatst in een gebied gelegen direct boven de nucleus caudatus. De geboeid hamilton spuit (vooraf geladen met cellen) wordt dan geplaatst in de gids schroef zodat 2 mm van de naald gaat verder dan de gids en de cellen worden ingespoten 3,5 mm binnen de nucleus caudatus. De spuit is later verwijderd en vervangen door een stilet (B). De automatische infusie apparaat (C) kan injecteren tot 10 dieren tegelijk. Hier worden vijf gelijktijdige injecties (D). Figuur 2: Schematische weergave van studie protocol. Cellen werden geïnjecteerd op dag 0 met de behandeling begint op dag 4. Controle dieren kregen een injectie van PBS (100 ul) IP, terwijl de behandelde groep kreeg een injectie van AMG102 (100 μg/100 pi) IP. Deze injecties werden gegeven om de tweede dag gedurende 10 dagen. Een totaal van zes injecties werden gegeven. Dieren werden vervolgens gecontroleerd op 70 dagen op tekenen van neurologische en lichamelijke stoornissen. Figuur 3: Kaplan-Meier survival curve te vergelijken controle en AMG102 behandelde muizen. Significant overlevingsvoordeel werd verkregen na de behandeling met AMG102 (p = 0,005). Figuur 4: microfoto's van coronale hersenen secties tonen de ontwikkeling van tumoren in de controle dieren (A) en geen hersentumor ontwikkeling in de AMG102 behandelde dieren (B). Schaal bar is 1 mm.

Discussion

The intracranial guide screw method presented here enables the rapid and reproducible establishment of intracranial xenografts and in the hands of a trained animal technician, this procedure is very easily performed without the need for a stereotactic device. Our method combines the use of a guide screw, to accurately locate the region of brain most suitable for in vivo tumor development, and an automated infusion pump that allows for the simultaneous inoculation of up to 10 animals at a time. The guide screw augmentation procedure takes less than 5 minutes to perform. The automated infusion of cells at 30 μl/hour takes just 10 minutes for a 5 μl volume. This ensures accurate dosing at a constant rate and reduces the risk of cell expulsion into the extra-cranial area due to increased intracranial pressure. We have also performed this procedure with 10 μl volumes and have not observed any extra-cranial tumor growth due to cellular reflux. As the automated infusion pump also allows several animals to be inoculated simultaneously we can inject up to 60 animals per hour compared to a stereotactic procedure which is limited to approximately 15 animals per hour.

The most critical step in this procedure is the location of guide screw in the skull as its position determines the ultimate location of the tumor bulk. If the guide screw is too central, the cells will be injected into a region between the two brain hemispheres whereas if the guide is placed to far forward, the cells will not be injected into the brain at all. It is therefore essential to be as accurate as possible in locating the guide 2.5 mm lateral and 1 mm anterior to the bregma¹. In this study we used a steel guide screw, although plastic guide screws are also available for those studies that require brain imaging such as MRI or PET⁶. Even if the automated infusion pump is cost prohibitive for some groups, cells can still be injected manually more quickly than stereotactic approaches. Overall, this rapid, accurate and reproducible method can be used to study glioma, medulloblastoma and brain stem tumors⁷. This procedure has been performed on over 500 mice between our two laboratories with deaths due to unexpected anesthetic reactions (<1%). Mice that were bolted with the guide screw and subsequently infused with cells did not die or suffer any neurological complications as a result of the procedure. Animals have survived past 100 days without any complications. Although we preferred to use a hairless mouse, an immuno-compromised mouse with hair like the SCID would be just as appropriate provided the skull hair was removed prior to the surgery to keep the site clean and to prevent hair interfering with guide screw.

There are several novel therapeutics currently being developed for the treatment of glioma^8-10. Recently we showed that subcutaneous U87MG glioma xenografts can be inhibited by treatment with AMG102³; a humanized antibody directed to HGF currently undergoing clinical evaluation in glioma⁵. We used the method describe here to establish intracranial U87MG tumors in the brains of nude mice. Our study clearly shows the utility of the method and demonstrates that AMG102 significantly inhibits the growth of orthotopic U87MG xenografts. We will continue to use this model to determine what other therapeutics can be used in combination with AMG102 to obtain more effective inhibition of tumor growth.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
DMEM/F12	Invitrogen	12634010
FCS	Bovogen	SFBS
Trypsin	Invitrogen	15050065
EDTA	Sigma	E6758
Balb/c nu/nu mice	ARC Perth
Screw Holder	Plastics One	SD-1
Drill Holder	Plastics One	DH-1
Drill Bit	Plastics One	D#60
Screw guide (metal)	Plastics One	C212SG
Screw Dummy (stylus)	Plastics One	C212SD
Hamilton Syringe (10 μl 26g cemented needle)	Grace Division Discovery Science	80075
PHD 22/2000 infusion pump	Harvard Apparatus	70-2003	Optional
Vetbond	3M	1469SB
Thermo pad	Harvard Apparatus	340390