अलगाव और Hoechst की विशेषता कम नकारात्मक फेफड़े mesenchymal स्टेम सेल माउस

Summary

इस अनुच्छेद में हम murine निवासी फेफड़ों mesenchymal स्टेम कोशिकाओं (फेफड़ों एमएससी), उनके विस्तार, लक्षण और immunomodulatory गुणों का विश्लेषण के अलगाव को प्रदर्शित करता है.

Abstract

ऊतक निवासी mesenchymal स्टेम सेल (एमएससी) ऊतकों की मरम्मत या उत्थान, तंतुमयता, सूजन, angiogenesis और ट्यूमर गठन की महत्वपूर्ण नियामकों हैं. साथ में ले ली इन अध्ययनों से संकेत मिलता है कि निवासी फेफड़ों फेफड़े ऊतक homeostasis, फुफ्फुसीय तंतुमयता (पीएफ) और धमनी उच्च रक्तचाप (PAH) जैसे रोगों के दौरान चोट और मरम्मत के दौरान एमएससी एक भूमिका निभा. यहाँ हम एक निवासी फेफड़ों एमएससी की आबादी को परिभाषित करने के लिए प्रौद्योगिकी का वर्णन. vivo में फेफड़े के ऊतकों में इस आबादी की परिभाषा मार्करों के एक सेट को परिभाषित का उपयोग प्रवाह cytometry और एक विशेष सेल प्रकार और समारोह के अध्ययन के द्वारा एक अच्छी तरह से विशेषता स्टेम सेल जनसंख्या के दोहराया अलगाव की सुविधा है.

Protocol

1. फेफड़े अलगाव बलिदान isoflurane की एक ज्यादा बाँझ तकनीक का उपयोग exsanguination द्वारा पीछा के साथ चूहों वयस्क चूहों (C57Bl6J; 18-20 ग्राम उम्र में 8-10 सप्ताह). प्रोफाइल थोड़ा उपभेदों के बीच अलग अलग होंगे. शल्य चिकित्सा डायाफ्राम निकालने के लिए, माउस के प्रत्येक पक्ष पर laterally ribcage के काटने से सीने गह्वर खुला. सही दिल वेंट्रिकल धीरे से perfusing फॉस्फेट की 3 5mls का उपयोग करके फेफड़ों से रक्त फ्लश खारा (पीबीएस) buffered. फेफड़ों हैंक्स के साथ भरा एक पेट्री डिश में ट्रेकिआ और बड़े ब्रांकाई और जगह को हटाने lobes काटना खारा buffered (HBSS). सभी फेफड़ों lobes संदंश के निम्न संग्रह के पकवान के ढक्कन पर ऊतक की जगह इस्तेमाल किया जाता है. ऊतक फिर छोटे टुकड़ों में पर्याप्त तरल के साथ प्रयोज्य नलियां का उपयोग करने के लिए उन्हें नम है, लेकिन है कि वे नाव और कदम इतना नहीं रखने कीमा बनाया हुआ है. चूहों के एक hindlimb काटना और अस्थि मज्जा को अलग करने के लिए एक धुंधला नियंत्रण के रूप में उपयोग करने के लिए फ़्लो सेटw cytometry फाटकों. अस्थि मज्जा (बी एम) के रूप में पहले 1 वर्णित दाग. 2. फेफड़े के ऊतकों से एक सिंगल सेल सस्पेंशन की तैयारी , बाँझ HBSS में भंग पूर्व गर्म 0.2% वोर्थिन्ग्तों टाइप 2 collagenase (बिल्ली LS004202 # बायोकेमिकल्स Worthington, Lakewood, NJ) के 5mls: 0.2g की मात्रा अनुपात के एक अनुकूलित ऊतक के वजन का उपयोग करके प्रत्येक फेफड़ों पचता है. मिश्रण 30 2,3 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में डूब जाता है . नमूना महीन चुर्ण बनाना अच्छी तरह से जब तक फेफड़े के ऊतकों को पचाने में एक 10ml विंदुक (लगभग 10 repetitions के) के माध्यम से आसानी से बहती है. 37 में अतिरिक्त 15 मिनट के लिए सेते ° C पूरा करने के लिए ऊतक हज़म और सुनिश्चित करता है एक और अधिक समान एकल कक्ष निलंबन. HBSS साथ फेफड़ों सेल निलंबन पतला और एक 5ml अवशिष्ट ऊतक टुकड़े फैलाने विंदुक के साथ महीन चुर्ण बनाना. एक 70μM सेल झरनी का उपयोग करने के लिए पचाया नहीं ऊतक टुकड़े को निकालने के निलंबन फ़िल्टर करें. नमूना multipl में विभाजित किया जा सकता है हैइस बिंदु पर ई शंक्वाकार ट्यूबों एक सेल झरनी ओवरलोडिंग को रोकने के लिए और समय कम. 1500 rpm और सतह पर तैरनेवाला निथारना पर 10 मिनट के लिए गोली सेल निलंबन. आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं, Resuspend सेल गोली धीरे कमरे के तापमान आरबीसी lysis बफर (# बिल्ली 00-4333-57 eBiosciences, सैन डिएगो, CA) का उपयोग कर. Lysis बफर निष्क्रिय और सेल एक 40μM सेल झरनी का उपयोग मलबे और सेल समुच्चय को निकालने के निलंबन फिल्टर HBSS के एक बराबर मात्रा में जोड़ें. प्रत्येक नमूने के पिपेट 10μl दाग हो और दोनों फेफड़ों और बी.एम. एक hemocytometer का उपयोग कर नमूने के लिए सेल नंबर की गिनती. नोट: कक्षों की कुल मात्रा का रिकॉर्ड है. गोली फेफड़ों की कोशिकाओं के 10 मिनट के लिए 1500 rpm पर centrifugation द्वारा एकल कक्ष निलंबन. # बिल्ली 11965-092) युक्त 2% भ्रूण bovi, 1×10 6 कोशिकाओं prewarmed में / मिलीलीटर (37 डिग्री सेल्सियस) DMEM + (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम, उच्च ग्लूकोज (Gibco, Carlsbad, CA पर दोनों फेफड़ों और बी.एम. कोशिकाओं Resuspendपूर्वोत्तर (FBS) सीरम और 10mm HEPES. Hoechst डाई 33342 (सिग्मा केमिकल कंपनी St.Louis, एमओ, बिल्ली B2261 #) के एक 1mg/ml स्टॉक समाधान तैयार पानी में और 1,4 बाँझ फिल्टर. Hoechst डाई -80 डिग्री सेल्सियस aliquots के रूप में संग्रहीत किया जा सकता है 5μg/ml की अंतिम एकाग्रता एकल कक्ष निलंबन के लिए (एक 1mg/ml शेयर की एक 200x मन्दन) 33342 डाई Hoescht जोड़ें. धीरे उलटा और सेते द्वारा वास्तव में 90 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में कोशिकाओं का मिक्स. 3. धुंधला और प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए फेफड़े सेल सस्पेंशन की तैयारी Hoechst दाग फेफड़ों की कोशिकाओं के साथ 90 मिनट के बाद सभी कदम 4 में निष्पादित किया जाना चाहिए डिग्री सेल्सियस या बर्फ पर डाई तपका को रोकने. गोली 4 बजे 10 मिनट के लिए 1500 rpm पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस और बर्फ ठंड धुंधला बफर (पीबीएस 2% FBS) में कोशिकाओं resuspend. कोई और अधिक 1×10 की तुलना में 7 कोशिकाओं / ट्यूब के एक एकाग्रता में Resuspend कोशिकाओं 300-2% से युक्त पीबीएस के 600μl का उपयोगFBS और 10mm HEPES. # बिल्ली ५,५९,८६४) फेफड़ों और बी.एम. नमूने के लिए बर्फ पर 10-15 मिनट के लिए सेते दौरान एक अस्थिर नियंत्रण भी शामिल है;. जोड़ें पर्याप्त रूप से CD45 एंटीबॉडी (आमतौर पर 1:200 CD45-APC के कमजोर पड़ने (बी.डी. Pharmingen, सैन डिएगो, CA tittered प्रयोगात्मक प्रक्रिया विश्लेषण फाटक सेट करने के लिए उपयोगी है. 4 में गोली कोशिकाओं डिग्री सेल्सियस 1500 rpm पर 5 मिनट के लिए. ठंडा धुंधला बफर (पीबीएस 2% FBS) के 500 μl में सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं निथारना. Prechilled तस्वीर टोपी polypropylene ट्यूबों पर स्थानांतरण (Fisherbrand, Schaumburg, आईएल, बिल्ली # 14-956-1D). Propidium आयोडाइड 2μg/ml मृत कोशिकाओं को बाहर का अंतिम एकाग्रता के लिए नमूने के लिए जोड़ें (PI, पीबीएस में 200μg/ml शेयर). PI Hoechst 33342 डाई प्रवाह cytometric विश्लेषण पर सही प्रतिदीप्ति प्रोफ़ाइल प्राप्त करने के साथ संयोजन में उपयोग किया जाना चाहिए. बर्फ पर स्टोर ट्यूबों, प्रवाह cytometry विश्लेषण तक प्रकाश से रक्षा की. 4. प्रवाह cytometry विश्लेषण परिभाषित करें और पृथकएक फेफड़े Mesenchymal स्टेम सेल (फेफड़ों एमएससी) जनसंख्या Hoechst डाई तपका का उपयोग करने के लिए एक साइड जनसंख्या (सपा) का पता लगाने यह परख निम्नलिखित साधन आवश्यकताओं: 488 एनएम और यूवी लेज़रों (350-355 एनएम) (450/65) नीले और लाल फिल्टर (675/50) के साथ यूवी लेजर पथ पर 2 डिटेक्टरों. यूवी लाल डिटेक्टर रेड सिग्नल के लिए उच्च संवेदनशीलता होनी चाहिए. यह पुराने सेल sorters के साथ एक समस्या हो सकती है. Chiller 5-10 पर नमूना बनाए रखने इकाई डिग्री सेल्सियस लेज़रों संरेखित करें और सेल छँटाई निर्माता प्रोटोकॉल निम्नलिखित के लिए सेट अप. (X-अक्ष) लाल और नीले (y-अक्ष) Hoechst संकेतों का उपयोग कर एक रेखीय पैमाने लीजिए. Photomultiplier ट्यूब voltages को समायोजित करने के लिए केंद्र के ऊपरी दाएँ में भूखंड पर G0/G1 चोटी अनुगामी ओर जनसंख्या का पर्याप्त प्रदर्शन के लिए अनुमति देने के स्थान. और कोशिका चक्र के एस चरण पूरे G2 का एक हिस्सा बंद पैमाने पर साजिश के ऊपरी दाएँ भाग पर हो सकता है. नीले हस्ताक्षरएनएएल अपेक्षाकृत उज्ज्वल है जबकि रेड सिग्नल मंद है. ठेठ MoFlo (Beckman कल्टर, मियामी, FL) XDP voltages के 425 और नीले रंग के लिए 650 लाल के लिए कर रहे हैं. मृत कोशिकाओं PI का उपयोग कर बाहर gated हैं. मानक PI पथ (उत्तेजना 488nm, 630nm उत्सर्जन) का इस्तेमाल किया जा सकता है. वैकल्पिक रूप से, PI भी यूवी लेजर द्वारा उत्साहित है और मृत सेल आबादी बंद पैमाने ओर जनसंख्या के दाईं ओर साजिश (सपा) पर स्थित है. यह FITC और पीई जैसे किसी भी अन्य fluorochromes से PI संकेत क्षतिपूर्ति की जरूरत alleviates. मूल Goodell विधि उत्तरार्द्ध 5-7 प्रक्रियाओं का पालन किया . विश्लेषण के दौरान एक अपेक्षाकृत कम दबाव अंतर रखें और पक्ष आबादी का तंग संकल्प सुनिश्चित छँटाई. सपा एक तरफ हाथ के रूप में फेफड़ों की कोशिकाओं के मुख्य आबादी से अलग दिखाई देता है. यह जनसंख्या Hoechst कम करार दिया है. Hoechst कम / सपा CD45 सकारात्मक और नकारात्मक एक हिस्टोग्राम (2,3 एफ का उपयोग कर आबादी को अलग करने के लिए विश्लेषण किया है1 igure). कोशिकाओं और Hoechst कम CD45 neg फेफड़ों एमएससी जनसंख्या का चयन और gating के बाद या तो एक मिश्रित जनसंख्या के रूप में एक ट्यूब या एकल कक्षों में छँटाई एक 96 – अच्छी तरह से थाली में 3 क्लोन अलग से एकत्र किया जा सकता है. सॉर्ट धारा विक्षेपन छँटाई प्लेट 25% ट्यूब छँटाई के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया है कि तुलना में अधिक ऊर्ध्वाधर सॉर्ट स्ट्रीम बनाने के लिए निकाला जाता है. ऊपरी बाएँ पर एक परीक्षण धारा पल्स भेजने और फिर एक 96 अच्छी तरह से थाली के निचले सही में अच्छी तरह से द्वारा क्रमबद्ध करें धारा निशाना लगाओ. हर अच्छी तरह से में कक्षों की इच्छित संख्या जमा सॉर्टर सॉफ्टवेयर थाली नक्शा सेट. एकल सेल क्लोनों अलग एक एकल फेफड़ों एमएससी संस्कृति मीडिया के 150μl (α सदस्य 20% FBS के साथ पूरक) में एक 96 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से में हल है. बाद सॉर्ट माध्यम की एक अतिरिक्त 100μl जोड़ा जाता है. 5. अलगाव, और फेफड़ों के एमएससी और क्लोन की संस्कृति विशेषता संस्कृतियोंए और छँटाई निम्नलिखित मिश्रित फेफड़ों एमएससी आबादी और एकल कक्ष क्लोन के विस्तार समान मानक संस्कृति शर्तों का उपयोग (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 और> 95% नमी) . कक्ष 16 घंटे के लिए निम्न अलगाव का पालन करने के लिए अनुमति दी जाती है. मीडिया हर 48 घंटे की जगह है (α सदस्य 20% FBS के साथ पूरक). जब कोशिकाओं को और अधिक तेजी से पैदा शुरू और 75-80% संगम वे passaged (चित्रा 2) के बीच तक पहुँचने. 2 मिनट से भी कम समय के लिए कक्ष prewarmed HBSS के साथ rinsed हैं और 37 में 0.5% trypsin / EDTA (Cellgro, Manassas, VA, 25-053-सीएल # बिल्ली) के साथ incubated सी °. कक्ष एक औंधा गुंजाइश का उपयोग करने के लिए एक सेल निलंबन की उपस्थिति की पुष्टि की निगरानी कर रहे हैं. फेफड़े एमएससी तो संस्कृति की वर्तमान प्रसार दर के आधार पर 01:02 या 01:03 के अनुपात में विभाजित हैं. फेफड़ों एमएससी अस्थिकोरक के पारंपरिक mesenchymal प्रजातियों वसाकोशिका और उपास्थिकोशिका स्वीकार किए जाते हैं mesenchymal मार्करों के उनके कोशिका की सतह अभिव्यक्ति में अंतर करने की क्षमता मैंप्रत्येक सेल तैयार करने के लिए मूल्यांकन किया. Cytogenetic बैंडिंग विश्लेषण भी सकल गुणसूत्र 2,3,8-11 असामान्यताएं के अभाव की पुष्टि के लिए किया जाता है. 6. एक कालोनी बनाने परख का उपयोग फेफड़ों एमएससी की गणन (CFU एफ) 1×10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए पूरा MesenCult मध्यम में कोशिकाओं (स्टेम सेल टेक्नोलॉजीज, वैंकूवर, ई.पू.) पतला. धारावाहिक dilutions प्रदर्शन 6×10 4 कोशिकाओं, 3×10 4 कोशिकाओं, 1.5 x10 4 मीडिया के 10ml में कोशिकाओं और 0.75 x10 4 कोशिकाओं के एक 100mm थाली में अंतिम सांद्रता को प्राप्त करने के लिए. विश्लेषण डुप्लिकेट या तीन प्रतियों में प्रत्येक कक्ष एकाग्रता के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं और छोटे सतह क्षेत्रों के लिए बढ़ाया जा सकता है. मानक शर्तों के तहत 10 दिनों के लिए संस्कृति की कोशिकाओं. जिस दिन 10 कोशिकाओं पीबीएस के साथ rinsed हैं और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 100% मेथनॉल का उपयोग करने के लिए तय. 0.4% w / v Giemsa धुंधला समाधान के साथ धुंधला द्वारा CFU एफ कालोनियों का पता लगाएँ(सिग्मा रासायनिक कं, सेंट लुइस, MO) विआयनीकृत जल के साथ 1:20 पतला. हवा शुष्क नमूने की अनुमति दें और कॉलोनी प्रति 25 से अधिक कोशिकाओं (चित्रा 3) युक्त कालोनियों की संख्या यों. 7. फेफड़ों एमएससी की immunomodulatory गुण की टी सेल प्रसार और Apoptosis पर विश्लेषण 6.25×10 अच्छी तरह से 4 प्रति फेफड़ों एमएससी कोशिकाओं 96 अच्छी तरह प्लेटों में चढ़ाया जाता है और खड़े रातोंरात 2 की अनुमति दी. सीडी 4 + टी सेल रिसेप्टर (TCR) ट्रांसजेनिक चूहों, टी कोशिकाओं है कि ovalbumin 323-339 पेप्टाइड पहचान के साथ ओ.टी. द्वितीय, spleens से कोशिकाओं + CD19 +, MHC-II + और ​​CD25 कोशिकाओं + CD8 घट द्वारा शुद्ध कर रहे हैं Miltenyi AutoMACS सेल सॉर्टर (Miltenyi, Auburn, CA). एंटीजन पेश कोशिकाओं (APC) के सकारात्मक MHC-II + कोशिकाओं 12 छँटाई के द्वारा अलग कर रहे हैं . APC 4% paraformaldehyde में तय कर रहे हैं, पीबीएस / 5% BSA/2mM EDTA में 3 बार धोया, और 0.5μg/ml / या 5μg मीटर के साथ भरी हुईएल OVA323 पेप्टाइड. नकली, APC गिरफ्तार वृद्धि 96 अच्छी तरह प्लेटें में फेफड़ों एमएससी के लिए जोड़ रहे हैं. 5μM Carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE, सिग्मा, St.Louis एमओ) के साथ 95% से अधिक शुद्ध सीडी 4 + 1×10 5 कोशिकाओं में चिह्नित कर रहे हैं और पीबीएस में अंधेरे में 5 मिनट के लिए incubated, पीबीएस 5% BSA के साथ धोया, और फिर करने के लिए जोड़ा APC और DMEM 5% FBS मीडिया में फेफड़ों एमएससी कोशिकाओं. कक्ष को तो 96 घंटे के लिए incubated हैं. सीडी 4 (APC Cy7); CD8 (ViolBlue); टी कोशिकाओं तो विरोधी (Cy5) विरोधी CD40 के साथ दाग रहे हैं Vbeta 5 (पीई) और Miltenyi MacsQuant 7 चैनल प्रवाह कोशिकामापी (Miltenyi, Aurburn, सीए) और का उपयोग assayed FloJo विश्लेषण सॉफ्टवेयर (Treestar, Ashland, OR). प्रसार CFSE का मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता में पृष्ठभूमि की तुलना में कमी के रूप में मापा जाता है, टी कोशिकाओं CFSE के साथ लेबल और उजागर APC (चित्रा 4) के लिए नहीं. टी कोशिकाओं को इस समय और व्यवहार्यता के trypan नीले अपवर्जन के साथ मूल्यांकन में गिने जाते हैं. 8. प्रतिनिधि परिणाम: <p class="Jove_content"> चित्रा फ्लो 1. Cytometric विश्लेषण और फेफड़े एमएससी की परिभाषा. फेफड़े के ऊतकों को पचाने में एकल सेल निलंबन Hoechst 33342 के साथ दाग रहे हैं और प्रवाह cytometry से विश्लेषण एक में मतभेद का पता लगाने. आगे तितर बितर (FSC) और साइड (एसएससी) स्कैटर और बी. Hoechst नीले और लाल प्रतिदीप्ति. एक तरफ जनसंख्या (सपा) की उपस्थिति फाटक में दिखाई देता है. Hoechst कम सपा तो सी अलग विश्लेषण किया है. CD45 फेफड़ों एमएससी की नकारात्मक जनसंख्या. CD45 फेफड़ों सपा के नकारात्मक अनुपात सकारात्मक आमतौर पर 70:30 / 60:40 हैं. चित्रा 2 अलगाव और फेफड़े एमएससी की संस्कृति. सेल छँटाई के द्वारा फेफड़ों एमएससी के संग्रह के बाद, कोशिकाओं 30mm α-सदस्य supplem का उपयोग कर बर्तन में चढ़ाया जाता है20% FBS साथ ented.. हौसले से सॉर्ट किया गया कोशिकाओं छोटे, गोल और चमकीले दिखाई देते हैं बी. के बाद एक mesenchymal phenotype के साथ लगभग 2-3 सप्ताह कालोनियों स्पष्ट बनने के प्रसार और अधिक स्पष्ट है. चित्रा 3 एमएससी की कालोनी बनाने के fibroblast परख द्वारा गणन विस्तारित फेफड़ों एमएससी वर्णित प्रोटोकॉल के प्रति CFU एफ परख के लिए चढ़ाया जाता है. और 10 दिनों के बाद Giemsa दाग कालोनियों स्पष्ट कर रहे हैं. बी कालोनियों बड़े हैं और एक के शामिल है. कुछ सौ कोशिकाओं. सी. कोशिकाओं mesenchymal phenotype प्रदर्शित करते हैं. एक सूचना और प्रसारण, स्केल बार = 0.5 सेमी, सी स्केल बार = 0.14 सेमी. चित्रा 4 CFSE आधार टी सेल प्रसार परख. फेफड़ों के एमएससी और antige की उपस्थिति के अभाव मेंn पेश कोशिकाओं (APC) + / – ovalbumin (OVA) CD40 सकारात्मक effector टी सेल CFSE तीव्रता में कमी है जो प्रसार को इंगित करता है (लाल वृत्त) का प्रदर्शन. टी सेल झिल्ली के CFSE प्रतिदीप्ति तीव्रता हर कोशिका विभाजन अर्थात् के साथ stoichiometrically घट जाती है. हर विभाजन के साथ. फेफड़ों एमएससी, APC की उपस्थिति में + / – OVA CD40 सकारात्मक effector टी सेल CFSE तीव्रता में कोई महत्वपूर्ण परिवर्तन है जो प्रसार की कमी को इंगित करता है (लाल वृत्त) का प्रदर्शन.

Discussion

हम एक शुरू करने के लिए बी.एम. hematopoietic कोशिकाओं की पहचान निवासी फेफड़ों एमएससी की एक विशिष्ट जनसंख्या को अलग विधि का इस्तेमाल किया अनुकूलित है. अलगाव के reproducibility के कारण इन कोशिकाओं को तो अच्छी तरह से किया गया एमएससी के रूप में विशेषता. उनके मूल निवासी वयस्क माउस फेफड़ों में (के रूप में व्युत्पन्न बी.एम. विरोध) और एक प्ररूपी ^और आणविक 2 प्रलेखित प्रोफ़ाइल के रूप में परिभाषित किया गया है. बार बार इस विशेषता आबादी को अलग करने की क्षमता जैविक और ऊतकों homeostasis और रोग के दौरान फेफड़ों एमएससी की भूमिका के महत्व के आगे के अध्ययन की अनुमति देता है. दोनों murine और मानव फेफड़े के ऊतकों में vivo में इस आबादी की हाल ही परिभाषा एक चिकित्सकीय अंतर्जात कोशिकाओं के बचाव के लिए चोट और बीमारी के दौरान फेफड़ों के मरम्मत की सुविधा में निर्देशित रणनीति के विकास की सुविधा.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	P-5368
Hanks buffered salt solution (HBSS)	Thermo Scientific	SH30588.01
0.2% Worthington type 2 collagenase	Worthington Biochemicals	LS004202
Red blood cell lysis buffer	eBiosciences	00-4333-57
DMEM	Invitrogen Gibco	11965-092
Hoechst 33342 dye	Sigma	B2261
CD45-APC	BD Pharmingen	559864
Propidium iodide	Sigma	81845
a-MEM	Thermo Scientific	SH30265.01
FBS	Invitrogen	16000-069
0.5% trypsin/EDTA	Cellgro	25-053-Cl
Complete MesenCult Medium	Stem Cell Technologies	05511
0.4% w/v Giemsa staining solution	Sigma	GS1L
4% paraformaldehyde	Electron Microscopy Services	15710	16% paraformeldehyde is diluted to 4% using PBS
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	Sigma	21888