تركيز من الأيضات من المجتمعات العوالق منخفض الكثافة لالايض البيئية باستخدام التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي
Summary
ويرد طريقة لاستخراج المستقلب من المجتمعات العوالق الجرثومية. ويتحقق كل مجتمع أخذ العينات عن طريق الترشيح على مرشحات أعدت خصيصا لذلك. بعد lyophilization، يتم استخراج مائي للذوبان في الأيضات. ويسمح هذا النهج لتطبيق الايض البيئية عبر omics التحقيقات في المجتمعات الميكروبية الطبيعية أو التجريبية.
Abstract
الايض البيئية هو حقل الناشئة التي تروج فهما جديدا في كيفية الرد على الكائنات الحية والتفاعل مع البيئة وغيرها كل على الصعيد البيوكيميائية 1. الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي) الطيفي هي واحدة من عدة تكنولوجيات، بما في ذلك الغاز اللوني الكتلة الطيفي (GC-MS)، مع وعد كبير لمثل هذه الدراسات. مزايا الرنين المغناطيسي هي أنه لا يصلح لتحاليل غير مستهدفة، وتوفر المعلومات الهيكلية، ويمكن الاستعلام عن الأطياف في الأدب الكمية والإحصائية ضد قواعد البيانات المتوفرة مؤخرا من أطياف المستقلب 2،3 فرد. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الجمع بين البيانات الرنين المغناطيسي الطيفي مع البيانات من مستويات omics الأخرى (على سبيل المثال transcriptomics، وعلم الجينوم) لتوفير فهم أكثر شمولا من الاستجابات الفسيولوجية من الأنواع لبعضها البعض والبيئة 4،5،6. ومع ذلك، الرنين المغناطيسي النووي هو أقل حساسية من تقنيات metabolomic الأخرى، مما يجعل من الصعب ا ف برقائق لأنظمة الميكروبية الطبيعية حيث السكان عينة يمكن أن يكون تركيز منخفض الكثافة ومنخفض مقارنة المستقلب إلى الأيضات من يعرف جيدا و. مصادر استخراجها بسهولة مثل الأنسجة كله، biofluids أو خلية ثقافات وبناء على ذلك، واقتصرت على بعض الدراسات البيئية المباشرة metabolomic من الميكروبات القيام بها لتاريخ النظم الإيكولوجية ذات الكثافة العالية القائمة على الثقافة أو المعرفة بسهولة مثل المضيف المتكافل النظم، وشارك في بناء ثقافات أو التلاعب في بيئة القناة الهضمية حيث وضع العلامات النظائر المستقرة يمكن أن يكون وبالإضافة إلى ذلك تستخدم لتعزيز إشارات الرنين المغناطيسي النووي 7،8،9،10،11،12. الطرق التي تسهل التركيز وجمع من الأيضات البيئية بتركيزات مناسبة لالرنين المغناطيسي النووي تعاني من نقص. منذ تم إيلاء اهتمام الأخيرة إلى الايض البيئية للكائنات الحية في البيئة المائية، حيث توسطت كثيرا من تدفق الطاقة والمواد من قبل المجتمع العوالق 13،14، وقد طورنا طريقة لتركيزاتنشوئها واستخراج كامل المجتمع الأيضات من النظم الميكروبية العوالق عن طريق الترشيح. يتم التعامل مع خصيصا المتاحة تجاريا ماء بولي-1 ،1-difluoroethene (PVDF) مرشحات لإزالة تماما extractables، التي يمكن أن تظهر إلا في شكل ملوثات في تحليلات لاحقة. ثم يتم استخدام هذه الفلاتر لتصفية تعامل العينات البيئية أو التجريبية من الفائدة. المرشحات التي تحتوي على مادة العينة الرطبة هي مجفف بالتجميد، ويتم استخراج مائي للذوبان في الأيضات مباشرة لطيف الرنين المغناطيسي النووي التقليدية باستخدام فوسفات البوتاسيوم موحدة العازلة استخراج 2. ويمكن تحليل البيانات المستمدة من هذه الأساليب الإحصائية لتحديد أنماط ذات معنى، أو دمجها مع مستويات omics أخرى لفهم شامل للمجتمع وظيفة النظام الإيكولوجي.
Protocol
Discussion
طريقة استخراج الترشيح والمستقلب تظاهر هنا يسمح للالكتلة الحيوية الميكروبية العوالق التي سيتم جمعها في كمية كافية لالايض الرنين المغناطيسي النووي. في حين يتجلى فقط من استخراج مائي للذوبان في الأيضات باستخدام مؤشرات الأداء الرئيسية و1D 1 H NMR، يمكن استخدام المذي?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث في جزء من المنح التي تقدم للمساعدة للبحث العلمي للطعن البحوث الاستكشافية (كيه)، والبحث العلمي (A) (كيه و SM) من وزارة التربية والتعليم، الثقافة والرياضة والعلوم، والتكنولوجيا، واليابان . وقدم FPR بتبريد زمالة (RCE) دعم إضافي. الكتاب إعراب عن امتنانهم للالدكاترة. إيسوكي Chikayama، Yasuyo Sekiyama وأوكاموتو مامي لتقديم المساعدة التقنية مع الرنين المغناطيسي النووي والتحليلات الإحصائية.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| 0.22 μm hydrophilic Durapore PVDF filters, 25 mm | Millipore | GVWP02500 | |
| Microanalysis Filter Holder, 25 mm, fritted glass support | Millipore | XX1002500 | |
| 3-place manifold, 47 mm, stainless steel | Millipore | XX2504735 | |
| KH2PO4 | Wako | 169-04245 | |
| K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
| Deuterium oxide, 2H > 90% | Campridge Isotope Laboratoties | DLM-4 | |
| DSS | Fluka | 92754 | |
| Automill | Tokken | TK-AM4 | Stainless steel crushers included |
| Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | |
| Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
| Vacuum evaporator | EYELA | CVE-3100 | |
| NMR | Bruker | DRX-500 with 5 mm-TXI probe | |
| Spectral binning tool | Originally developed | FT2DB | https://database.riken.jp/ecomics/ |
| Metabolite annotation tool and database | Originally developed | SpinAssign | http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search |
Riferimenti
- Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: a critical review and future perspectives. Metabolomics. 5, 3-21 (2008).
- Chikayama, E., et al. Statistical indices for simultaneous large-scale metabolite detections for a single NMR spectrum. Anal. Chem. 82, 1653-1658 (2010).
- Lewis, I. A., Schommer, S. C., Markley, J. L. rNMR: open source software for identifying and quantifying metabolites in NMR spectra. Magn. Reson. Chem. 47, S123-S126 (2009).
- Li, M., et al. Symbiotic gut microbes modulate human metabolic phenotypes. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2117-2122 (2008).
- Mochida, K., Furuta, T., Ebana, K., Shinozaki, K., Kikuchi, J. Correlation exploration of metabolic and genomic diversity in rice. BMC Genomics. 10, 568 (2009).
- Fukuda, S., et al. Bifidobacteria can protect from enteropathogenic infection through production of acetate. Nature. 469, 543-547 (2011).
- Kikuchi, J., Hirayama, T. Practical aspects of stable isotope labeling of higher plants for a hetero-nuclear multi-dimensional NMR-based metabolomics. Methods Mol. Biol. 358, 273-286 (2007).
- Martin, F. P., et al. A top-down systems biology view of microbiome-mammalian metabolic interactions in a mouse model. Mol. Syst. Biol. 3, 112 (2007).
- Mahrous, E. A., Lee, R. B., Lee, R. E. A rapid approach to lipid profiling of mycobacteria using 2D HSQC NMR maps. J. Lipid Res. 49, 455-463 (2008).
- Fukuda, S., et al. Evaluation and characterization of bacterial metabolic dynamics with a novel profiling technique, real-time metabolotyping. PloS ONE. 4, e4893 (2009).
- Date, Y., et al. New monitoring approach for metabolic dynamics in microbial ecosystems using stable-isotope-labeling technologies. J. Biosci. Bioeng. 110, 87-93 (2010).
- Nakanishi, Y., et al. Dynamic omics approach identifies nutrition-mediated microbial interactions. J. Proteome Res. 10, 824-836 (2011).
- Falkowski, P., Barber, R., Smetacek, V. Biogeochemical controls and feedbacks on ocean primary production. Science. 281, 200-207 (1998).
- Viant, M. R. Metabolomics of aquatic organisms: the new ‘omics’ on the block. Mar. Ecol. Prog. Ser. 332, 301-306 (2007).
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Evaluation of a semipolar solvent system as a step toward heteronuclear multidimensional NMR-based metabolomics for 13C-labeled bacteria, plants, and animals. Anal. Chem. 83, 719-726 (2011).
- Delaglio, F., et al. NMRPipe: A multidimensional spectral processing system based on UNIX pipes. J. Biomol. NMR. 6, 277-293 (1995).
- Wang, T., et al. Automics: an integrated platform for NMR-based metabonomics spectral processing and data analysis. BMC Bioinformatics. 10, 83 (2009).
- Eldon, L., et al. BioMagResBank. Nucleic Acids Res. 36, D402-D408 (2007).
- Sekiyama, Y., Chikayama, E., Kikuchi, J. Profiling polar and semipolar plant metabolites throughout extraction processes using a combined solution-state and high-resolution magic angle spinning NMR approach. Anal. Chem. 82, 1643-1652 (2011).
