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Concentrazione dei metaboliti a bassa densità Comunità planctoniche per Metabolomica ambientali utilizzando la spettroscopia a risonanza magnetica nucleare

DOI:

10.3791/3163

April 7th, 2012

In This Article

Summary

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Un metodo per l'estrazione metabolita da parte delle comunità microbiche planctonici è presentato. Campionamento intera comunità si realizza mediante filtrazione su filtri appositamente preparati. Dopo liofilizzazione, acquoso-solubili metaboliti vengono estratti. Questo approccio consente per l'applicazione della metabolomica ambientali trans-omiche indagini di comunità microbiche naturali o sperimentali.

Abstract

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Metabolomica ambientale è un settore emergente che sta promuovendo una nuova comprensione in come gli organismi rispondere e interagire con l'ambiente e l'altro a livello biochimico 1. Risonanza magnetica nucleare (NMR) è una delle varie tecnologie, compreso il gas cromatografia-spettrometria di massa (GC-MS), con la promessa di un notevole per tali studi. I vantaggi di NMR sono che è adatto per le analisi non mirati, fornisce informazioni strutturali e spettri può essere interrogato in maniere quantitativi e statistici nei confronti di banche dati disponibili di recente dei singoli spettri metabolita 2,3. Inoltre, i dati NMR spettrali possono essere combinati con dati provenienti da altri livelli omiche trascrittomica (ad esempio, la genomica), per fornire una comprensione più completa delle risposte fisiologiche di taxa gli uni agli altri e l'ambiente 4,5,6. Tuttavia, NMR è meno sensibile rispetto ad altre tecniche metabolomica, rendendo difficile apply ai sistemi microbici naturali dove campioni di popolazione possono essere le concentrazioni a bassa densità e basso rispetto al metabolita metaboliti ben definite e facilmente estraibili fonti, quali tessuti interi, biofluidi o cellulo-culture. Di conseguenza, i pochi studi ambientali diretti metabolomica di microbi eseguiti fino ad oggi sono stati limitati alla cultura-based o facilmente definito ad alta densità ecosistemi come host-simbionti sistemi, costruiti co-colture o manipolazioni dell'ambiente intestinale in cui l'etichettatura isotopi stabili possono essere inoltre utilizzati per migliorare segnali NMR 7,8,9,10,11,12. Metodi che facilitano la concentrazione e la raccolta dei metaboliti ambientali a concentrazioni adatte NMR mancano. Dal recente attenzione è stata data alle metabolomica ambientali degli organismi nell'ambiente acquatico, in cui è mediata gran parte del flusso di energia e materiali da parte della comunità planctoniche 13,14, abbiamo sviluppato un metodo per la concentrazionezione e l'estrazione di tutta la comunità-metaboliti microbici planctonici dai sistemi di filtrazione. Disponibili in commercio idrofile poli-1 ,1-difluoroethene (PVDF), i filtri sono appositamente trattati per rimuovere completamente estraibili, che possono altrimenti apparire come contaminanti nelle analisi successive. Questi filtri trattati vengono poi usati per filtrare i campioni ambientali o sperimentale di interesse. Filtri contenenti il materiale umido campione sono liofilizzato e acquosa metaboliti solubili vengono estratti direttamente per la spettroscopia NMR convenzionale utilizzando un tampone fosfato di potassio standardizzato di estrazione 2. I dati derivano da questi metodi possono essere analizzati statisticamente per identificare i modelli significativi, o integrato con gli altri livelli omiche per la comprensione globale della comunità e il funzionamento dell'ecosistema.

Protocol

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1. Preparazione filtro per rimuovere estraibili

  1. Utilizzare 25 mm di diametro 0,22 micron pori di dimensioni Durapore filtri PVDF idrofilo (Millipore). Mettere filtri in un bicchiere pulito da 500 ml Pyrex con una pinzetta. Pre-risciacquo tre volte con acqua distillata. Agitare così come si risciacquo per evitare che i filtri si attacchino tra loro. Aggiungere 300 ml Milli-Q (Millipore) o equivalente di alta qualità dell'acqua. Autoclavare per facilitare la rimozione completa estraibili dai filtri.
  2. Eliminare il Milli-Q e di nuovo triple lavare i filtri, questa volta con Milli-Q. Utilizzo dei filtri singoli pinzette posto su una superficie asciutta....

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Discussion

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L'estrazione filtrazione e metabolita metodo illustrato qui permette per la biomassa microbica planctoniche da raccogliere in quantità sufficiente per metabolomica NMR. Mentre solo di estrazione acquosa-solubili metaboliti utilizzando KPI e 1D 1 H NMR è dimostrata, altri solventi da estrazione e approcci spettroscopici possono essere utilizzati. Un esempio utile è l'uso di metanolo deuterato come solvente semi-polare, che ha dimostrato di produrre spettri NMR superiore da campioni eterogenei ed è meno.......

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Disclosures

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Non ci sono conflitti di interesse dichiarati.

Acknowledgements

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Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal Grants-in-Aid per la ricerca scientifica per contestare la ricerca esplorativa (JK), e della Ricerca Scientifica (A) (JK e SM) dal Ministero della Pubblica Istruzione, Cultura, Sport, Scienza e Tecnologia, Giappone . Una borsa di studio RIKEN FPR (RCE) offerto un sostegno supplementare. Gli autori esprimono la loro gratitudine a Drs. Eisuke Chikayama, Yasuyo Sekiyama e Mami Okamoto per l'assistenza tecnica con la NMR e analisi statistiche.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Nome del reattivo Azienda Numero di catalogo Comments
0,22 micron idrofile Durapore filtri PVDF, 25 mm Millipore GVWP02500
Holder microanalisi Filter, 25 mm, supporto di vetro poroso Millipore XX1002500
3-posto collettore, 47 mm, in acciaio inox Millipore XX2504735
KH 2 PO 4 Wako 169-04245
K 2 HPO 4 Wako 164-04295
Ossido di deuterio, 2 H> 90% Campridge Isotope Laboratoties DLM-4 >
DSS Fluka 92754
Automill Tokken TK-AM4 Frantoi in acciaio inox incluse
Thermomixer confort Eppendorf 5355 000.011
Bioruptor Diagenode UCD-200
Vacuum evaporatore EYELA CVE-3100
NMR Bruker DRX-500 con 5 mm TXI sonda
Spectral strumento di binning Originariamente sviluppato FT2DB https://database.riken.jp/ecomics/
Annotazione strumento di Metabolita e database Originariamente sviluppato SpinAssign = Nmr_search "> http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search

References

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  1. Bundy, J. G., Davey, M. P., Viant, M. R. Environmental metabolomics: a critical review and future perspectives. Metabolomics. 5, 3-21 (2008).
  2. Chikayama, E., et al. Statistical indices for simultaneous large-scale metabolite detections for a si....

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Nuclear Magnetic Resonance SpectroscopyEnvironmental MetabolomicsPlanktonic CommunitiesMetabolite ConcentrationFiltration MethodLyophilization ExtractionPotassium Phosphate BufferNMR Spectral AnalysisPCA Statistical AnalysisMulti omics Integration

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