Een methode voor het metaboliet extractie van microbiële gemeenschappen plankton wordt gepresenteerd. Hele gemeenschap bemonstering wordt bereikt door middel van filtratie op speciaal geprepareerde filters. Na lyofilisatie worden waterige oplosbare metabolieten geëxtraheerd. Deze aanpak maakt het voor de toepassing van milieu-metabolomics tot de trans-omics onderzoek van de natuurlijke of experimentele microbiële gemeenschappen.
Milieu-metabolomics is een opkomend gebied dat nieuwe inzicht is het bevorderen van de manier waarop organismen reageren op en interageren met de omgeving en elkaar op de biochemische niveau 1. Nucleaire magnetische resonantie (NMR) spectroscopie is een van de verschillende technologieën, zoals gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS), met veel belofte voor dergelijke studies. Voordelen van NMR is dat het geschikt is voor ongerichte analyses, biedt structurele informatie en spectra kunnen worden opgevraagd in kwantitatieve en statistische manieren tegen de laatst beschikbare databases van individuele metaboliet spectra 2,3. Daarnaast kunnen NMR spectrale data worden gecombineerd met gegevens uit andere omics niveaus (bijv. transcriptomics, genomics) om een meer omvattend begrip van de fysiologische reacties van taxa op elkaar en het milieu 4,5,6 te geven. Echter, NMR is minder gevoelig dan andere metaboloom technieken, waardoor het moeilijk is aplagen aan de natuurlijke microbiële systemen waar steekproefpopulaties kan een lage dichtheid en metaboliet concentraties laag in vergelijking met metabolieten van goed gedefinieerde en gemakkelijk winbare bronnen zoals hele weefsels, biovloeistoffen of cel-culturen. Bijgevolg hebben de weinige directe milieu metabolietvorming van microben tot nu toe uitgevoerde beperkt tot cultuur-gebaseerd of gemakkelijk te definiëren met hoge dichtheid ecosystemen zoals host-symbiont systemen, gebouwd co-culturen of manipulaties van de darm omgeving waar stabiele isotopen de etikettering kunnen worden tevens worden gebruikt ter verbetering NMR signalen 7,8,9,10,11,12. Methoden dat de concentratie en verzamelen van het milieu metabolieten vergemakkelijken concentraties voor NMR ontbreken. Sinds de recente aandacht is besteed aan de milieu-metabolomics van organismen in het aquatisch milieu, waar veel van de energie-en materiaalstroom wordt gemedieerd door de planktonische gemeenschap 13,14, hebben we een methode ontwikkeld voor de concentratieTIE en extractie van hele gemeenschap metabolieten van planktonische microbiële systemen door middel van filtratie. Handel verkrijgbare hydrofiele poly-1 ,1-difluoroethene (PVDF) filters speciaal behandeld voor het verwijderen extraheerbare, die anders kunnen als verontreinigingen in de daaropvolgende analyse. Deze behandelde filters worden vervolgens gebruikt om milieu-of experimentele monsters van belang te filteren. Filters met de natte monstermateriaal gevriesdroogd en waterige oplosbare metabolieten direct geëxtraheerd voor conventionele NMR spectroscopie een gestandaardiseerde kaliumfosfaatbuffer extractiebuffer 2. De gegevens zijn afgeleid van deze methoden kan worden geanalyseerd statistisch betekenisvolle patronen te identificeren, of geïntegreerd met andere omics niveaus voor uitgebreide kennis van de gemeenschap en ecosysteem functie.
De filtratie en metaboliet extractiemethode aangetoond hier zorgt voor microbiële plankton biomassa kan worden geïnd in voldoende hoeveelheid voor NMR metabolomics. Terwijl slechts extractie van water-oplosbare metabolieten met behulp van KPI en 1D 1 H NMR is aangetoond, kunnen andere extractiemiddelen en spectroscopische methoden worden gebruikt. Een goed voorbeeld is het gebruik van gedeutereerde methanol als semi-polair oplosmiddel, dat is aangetoond dat superieure NMR spectra produceren van heterogene m…
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd mede ondersteund door subsidies-in-Steun voor Wetenschappelijk Onderzoek voor de aanhouding van verkennend onderzoek (JK), en Wetenschappelijk Onderzoek (A) (JK en SM) van het ministerie van Onderwijs, Cultuur, Sport, Wetenschap en Technologie, Japan . Een RIKEN FPR fellowship (RCE), mits extra ondersteuning. De auteurs uiten hun dankbaarheid aan Drs. Eisuke Chikayama, Yasuyo Sekiyama en Mami Okamoto voor technische bijstand met behulp van NMR en statistische analyses.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
0.22 μm hydrophilic Durapore PVDF filters, 25 mm | Millipore | GVWP02500 | |
Microanalysis Filter Holder, 25 mm, fritted glass support | Millipore | XX1002500 | |
3-place manifold, 47 mm, stainless steel | Millipore | XX2504735 | |
KH2PO4 | Wako | 169-04245 | |
K2HPO4 | Wako | 164-04295 | |
Deuterium oxide, 2H > 90% | Campridge Isotope Laboratoties | DLM-4 | |
DSS | Fluka | 92754 | |
Automill | Tokken | TK-AM4 | Stainless steel crushers included |
Thermomixer comfort | Eppendorf | 5355 000.011 | |
Bioruptor | Diagenode | UCD-200 | |
Vacuum evaporator | EYELA | CVE-3100 | |
NMR | Bruker | DRX-500 with 5 mm-TXI probe | |
Spectral binning tool | Originally developed | FT2DB | https://database.riken.jp/ecomics/ |
Metabolite annotation tool and database | Originally developed | SpinAssign | http://prime.psc.riken.jp/?action=nmr_search |