Créer deux dimensions Substrats motifs pour le confinement des protéines et de cellules
Summary
Monocouches auto-assemblées (SAM) formé à partir de thiols à long alcane sur l'or de fournir des substrats bien définis pour la formation de motifs protéiques et de l'isolement cellulaire. D'impression par microcontact hexadecanethiol l'aide d'un polydiméthylsiloxane (PDMS) de timbre suivie par remblayage avec un glycol terminée alcane thiols monomère produit un modèle où les protéines et les cellules s'adsorbent seulement pour la région estampillé hexadecanethiol.
Abstract
Impression par microcontact fournit une méthode rapide, hautement reproductible pour la création de substrats motifs bien définis. 1 Pendant l'impression par microcontact peut être employée pour imprimer directement un grand nombre de molécules, y compris les protéines, l'ADN 2, 3 et silanes, 4 la formation de l'auto -assemblés monocouches (SAM) de longues alcane thiols sur l'or offre un moyen simple de limiter les protéines et les cellules pour des modèles spécifiques contenant des régions adhésif et résistant. Ce confinement peut être utilisé pour contrôler la morphologie cellulaire et est utile pour l'examen d'une variété de questions en protéines et en biologie cellulaire. Ici, nous décrivons une méthode générale pour la création de motifs protéiques bien définis pour les études cellulaires 5 Ce processus comprend trois étapes:. La production d'un maître à motifs en utilisant la photolithographie, impression de la création d'un timbre en PDMS, et microcontact d'un or- substrat revêtu. Une fois modelée, ces substrats de culture de cellules sont capables de confiner les protéines et / ou de cellules (cellules primaires ou de lignées cellulaires) pour le motif.
L'utilisation de la chimie monocouche auto-assemblée permet un contrôle précis sur les régions à motifs adhésifs protéines / cellules et non-adhésive régions, ce qui ne peut être réalisée à l'aide d'emboutissage directe des protéines. Hexadecanethiol, la longue chaîne alcane thiols utilisés dans l'étape d'impression par microcontact, produit une surface hydrophobe qui adsorbe facilement protéines de la solution. Le glycol terminée par un thiol, utilisés pour le remblayage des régions non-imprimées du substrat, crée une monocouche qui est résistant à l'adsorption des protéines et donc la croissance cellulaire. 6 Ces monomères thiol produisent des monocouches hautement structurés qui définissent précisément les régions du substrat qui peuvent soutenir l'adsorption des protéines et la croissance cellulaire. En conséquence, ces substrats sont utiles pour une large variété d'applications de l'étude du comportement intercellulaire 7 à la création de la microélectronique. 8
Alors que d'autres types de chimie monocouche ont été utilisés pour des études de culture de cellules, y compris les travaux de notre groupe en utilisant trichlorosilanes pour créer des motifs directement sur des substrats en verre, 9 monocouches à motifs formés à partir de thiols alcane sur l'or sont simples à préparer. Par ailleurs, les monomères utilisés pour la préparation monocouche sont disponibles dans le commerce, stable, et ne nécessitent pas de stockage ou la manipulation sous atmosphère inerte. Substrats préparés à partir de thiols Patterned alcane peuvent également être recyclés et réutilisés plusieurs fois, le maintien de l'isolement cellulaire. 10
Protocol
Discussion
Un certain nombre de questions peuvent surgir dans la production lithographique de maître utilisé pour la création de timbre de PDMS. Sous-exposition des résultats plaquette résister à revêtement dans les modèles flous et indistincts et la surexposition des résultats plaquette résister à revêtement en fonctionnalités élargie ou manquant. En général, les maîtres avec des tailles disposent de grandes (> 10 mm) sont relativement faciles à motif et se développer, alors que les maîtres avec de petites …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier l'ensemble du groupe Maurer à l'Université Washington, dont la connaissance collective a fait de ce protocole possible. Le financement de ce travail est fourni par le National Institute of Mental Health (1R01MH085495).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Silicon wafer | Wafer Reclaim Services | 2 inch | |
| Spin coater/hot plate | Brewer Science | Cee 200CB Spin-Bake System | |
| AZ9245 Photoresist | Mays Chemical Company | 105880034-1160 | |
| Direct-write photolithography system | Microtech s.r.l. | LW325 LaserWriter System | |
| Mask Aligner | HTG | 3HR | |
| AZ 400K Developer | Mays Chemical Company | 105880018-1160 | |
| Sylgard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| 25 mm no. 1 round glass coverslips | VWR | 16004-310 | |
| Plasma Oxidizer | Diener | Femto | |
| Titanium pieces Kamis | Incorporated | 99.95% pure | |
| Gold pellets | Kamis Incorporated | 99.999% pure | |
| Electron-beam evaporator | Kurt J. Lesker | PVD 75 Thin Film Deposition System | with electron-beam accessory |
| Hexadecanethiol | Alfa Aesar | A11362 | |
| 1-mercaptoundec-11-yl)tetra(ethyleneglycol) | Sigma Aldrich | 674508 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | 200 proof, absolute |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| DPBS | VWR | 4500-434 | Without calcium and magnesium |
| Mouse Laminin I | VWR | 95036-762 | |
| Human Plasma Fibronectin | Invitrogen | 33016-015 | |
| AlexaFluor® 647 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A-20006 | |
| MitoTracker Red 580 | Invitrogen | M22425 | |
| AlexaFluor® 350 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A-10168 | |
| Anti-laminin antibody | Fisher Scientific | AB2034MI |
Riferimenti
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