Att skapa två-dimensionell Mönstrad substrat för Protein och Cell inneslutning
Summary
Self-monterade monolager (SAMS) bildas från långa tioler kedja alkan på guld ger väldefinierade substrat för bildning av protein mönster och cell instängdhet. Microcontact utskrift av hexadecanethiol med hjälp av en Polydimetylsiloxan (PDMS) stämpel följt av återfyllning med en glykol-terminerad alkan tiol monomer producerar ett mönster där protein och celler adsorbera endast stämplade hexadecanethiol regionen.
Abstract
Microcontact utskrift ger snabb, mycket reproducerbar metod för att skapa väldefinierade mönstrade substrat. 1 Medan microcontact utskrift kan användas för att direkt skriva ut ett stort antal molekyler inklusive proteiner, 2 DNA, 3 och silaner, 4 bildandet av själv monterade monolager (SAMS) från långa tioler kedja alkan på guld är ett enkelt sätt att begränsa proteiner och celler till specifika mönster som innehåller lim och resistenta regioner. Denna instängdhet kan användas för att styra cellmorfologin och är användbart för att pröva en mängd olika frågor i protein och cellbiologi. Här beskriver vi en generell metod för att skapa väldefinierade protein mönster för cellulära studier 5 Denna process omfattar tre steg. Produktionen av en mönstrad mästare med fotolitografi, skapandet av ett PDMS stämpeln och microcontact tryckning av en guld- belagda substrat. När mönstrade dessa cellodling substrat kan begränsa proteiner och / eller celler (primär celler eller cellinjer) till mönstret.
Användningen av egna sammansatta cellslager kemi möjliggör exakt kontroll över de mönstrade protein / cell självhäftande regioner och icke-självhäftande regioner, vilket inte kan uppnås med direkta protein stämpling. Hexadecanethiol, den långa kedjan alkan tiol används i microcontact tryckningen producerar en hydrofob yta som lätt adsorberar protein från lösningen. Den glykol-terminerad tiol, som används för återfyllning icke-tryckta regioner i substratet, skapar en monolager som är resistent mot protein adsorption och därmed celltillväxt. 6 Dessa tiol monomerer producerar mycket strukturerade monolager att exakt definiera delar av substrat som kan stödja protein adsorption och celltillväxt. Som ett resultat av dessa substrat är användbara för en mängd olika applikationer från studier av intercellulära beteende 7 till skapandet av mikroelektronik. 8
Även andra typer av monolager kemi har använts för studier cellodling, inklusive arbete från vår grupp att använda triklorsilaner att skapa mönster direkt på glas substrat, 9 mönstrade monolager bildas från alkan tioler på guld är okomplicerade att förbereda sig. Dessutom monomerer används för cellslager beredning är kommersiellt tillgängliga, stabila, och inte kräver lagring eller hantering under inert atmosfär. Mönstrad substrat framställda av alkan tioler kan också återvinnas och återanvändas flera gånger, att upprätthålla cell förlossning. 10
Protocol
Discussion
Ett antal frågor kan uppstå i den litografiska produktion av master som används för PDMS stämpel skapande. Underexponering av motstå-belagda wafer resulterar i disigt och otydligt mönster och överexponering av motstå-belagda wafer resulterar i större eller saknade funktioner. I allmänhet mästare med stora inslag storlekar (> 10 mikrometer) är relativt lätta att mönster och utvecklas, medan mästare med mindre funktioner kan kräva omfattande optimering av photopatterning och utveckling parametrar (utö…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka för hela Maurer gruppen vid Washington University, vars samlade kunskap har gjort detta protokoll möjligt. Finansieringen av detta arbete är från National Institute of Mental Health (1R01MH085495).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Silicon wafer | Wafer Reclaim Services | 2 inch | |
| Spin coater/hot plate | Brewer Science | Cee 200CB Spin-Bake System | |
| AZ9245 Photoresist | Mays Chemical Company | 105880034-1160 | |
| Direct-write photolithography system | Microtech s.r.l. | LW325 LaserWriter System | |
| Mask Aligner | HTG | 3HR | |
| AZ 400K Developer | Mays Chemical Company | 105880018-1160 | |
| Sylgard 182 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| 25 mm no. 1 round glass coverslips | VWR | 16004-310 | |
| Plasma Oxidizer | Diener | Femto | |
| Titanium pieces Kamis | Incorporated | 99.95% pure | |
| Gold pellets | Kamis Incorporated | 99.999% pure | |
| Electron-beam evaporator | Kurt J. Lesker | PVD 75 Thin Film Deposition System | with electron-beam accessory |
| Hexadecanethiol | Alfa Aesar | A11362 | |
| 1-mercaptoundec-11-yl)tetra(ethyleneglycol) | Sigma Aldrich | 674508 | |
| Ethanol | Pharmco-aaper | 111000200 | 200 proof, absolute |
| Parafilm | VWR | 52858-000 | |
| DPBS | VWR | 4500-434 | Without calcium and magnesium |
| Mouse Laminin I | VWR | 95036-762 | |
| Human Plasma Fibronectin | Invitrogen | 33016-015 | |
| AlexaFluor® 647 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A-20006 | |
| MitoTracker Red 580 | Invitrogen | M22425 | |
| AlexaFluor® 350 carboxylic acid, succinimidyl ester | Invitrogen | A-10168 | |
| Anti-laminin antibody | Fisher Scientific | AB2034MI |
Riferimenti
- Wilbur, J., Kumar, A., Biebuyck, H., Kim, E., Whitesides, G. Microcontact printing of self-assembled monolayers: Applications in microfabrication. Nanotechnology. 7, 452-457 (1996).
- Chang, J., Brewer, G., Wheeler, B. A modified microstamping technique enhances polylysine transfer and neuronal cell patterning. Biomaterials. 24, 2863-2870 (2003).
- Lange, S., Benes, V., Kern, D., Horber, J., Bernard, A. Microcontact printing of DNA molecules. Analytical Chemistry. , 1641-1647 (2004).
- Xia, Y., Mrksich, M., Kim, E., Whitesides, G. Microcontact printing of octadecylsiloxane on the surface of silicon dioxide and its application in microfabrication. J. Am. Chem. Soc. , 9576-9577 (1995).
- Mrksich, M., Dike, L., Tien, J., Ingber, D., Whitesides, G. Using microcontact printing to pattern the attachment of mammalian cells to self-assembled monolayers of alkanethiolates on transparent films of gold and silver. Experimental Cell Research. , 305-313 (1997).
- Prime, K. L., Whitesides, G. M. Adsorption of proteins onto surfaces containing end-attached oligo(ethylene oxide) – a model system using self-assembled monolayers. J. Am. Chem. Soc. 115, 10714-10721 (1993).
- Raghavan, S., Desai, R., Kwon, Y., Mrksich, M., Chen, C. Micropatterned Dynamically Adhesive Substrates for Cell Migration. Langmuir. , 17733-17738 (2010).
- Rogers, J., Bao, Z., Baldwin, K., Dodabalapur, A., Crone, B., Raju, V. R., Kuck, V., Katz, H., Amundson, K., Ewing, J. Paper-like electronic displays: Large-area rubber-stamped plastic sheets of electronics and microencapsulated electrophoretic inks. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 4835-4840 (2001).
- Yanker, D., Maurer, J. Direct printing of trichlorosilanes on glass for selective protein adsorption and cell growth. Molecular Biosystems. 4, 502-504 (2008).
- Johnson, D., Maurer, J. Recycling and reusing patterned self-assembled monolayers for cell culture. Chemical Communications. , 520-522 (2011).
- Herne, T., Tarlov, M. Characterization of DNA probes immobilized on gold surfaces. J. Am. Chem. Soc. , 8916-8920 (1997).
- Hanson, E., Schwartz, J., Nickel, B., Koch, N., Danisman, M. Bonding self-assembled, compact organophosphonate monolayers to the native oxide surface of silicon. J. Am. Chem. Soc. , 16074-16080 (2003).
- Johannes, M., Cole, D., Clark, R. Atomic force microscope based nanofabrication of master pattern molds for use in soft lithography. Applied Physics Letters. , (2007).
- Bessueille, F., Pla-Roca, M., Mills, C. A., Martinez, E., Samitier, J., Errachid, A. Submerged microcontact printing (SμCP): An unconventional printing technique of thiols using high aspect ratio, elastomeric stamps. Langmuir. , 12060-12063 (2005).
- Xia, Y., Whitesides, G. Extending microcontact printing as a microlithographic technique. Langmuir. , 2059-2067 (1997).
- Biasco, A., Pisignano, D., Krebs, B., Pompa, P. P., Persano, L., Cingolani, R., Rinaldi, R. Conformation of microcontact-printed proteins by atomic force miroscopy molecular sizing. Langmuir. , 5154-5158 (2005).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact printing of proteins for cell biology. J Vis Exp. (22), e1065-e1065 (2008).
- Piner, R., Zhu, J., Xu, F., Hong, S., Mirkin, C. “Dip-pen” nanolithography. Science. 283, 661-663 (1999).
- Ryan, D., Parviz, B. A., Linder, V., Semetey, V., Sia, S. K., Su, J., Mrksich, M., Whitesides, G. M. Patterning multiple aligned self-assembled monolayers using light. Langmuir. , 9080-9088 (2004).
