Hjärta Dissection i Larvernas, unga och vuxna Zebrafish, Danio rerio</em
Summary
En tydlig och standardiserad metod för dissekering och isolering av zebrafisk hjärtat på flera utvecklingsstadier beskrivs. Annotering och kvantifiering tekniker diskuteras också.
Abstract
Zebrafisk har blivit en positiv och praktisk modell organism för studier av embryonala hjärtat utveckling (se guide 1-6), men arbetet undersöka post-embryonala genom vuxen hjärt utveckling har varit begränsade 7-10. Undersöka ändra morfologi mogna och åldrande hjärta begränsas av bristen på tekniker för mellanstationer och isolera unga och vuxna hjärtan. För att analysera hjärtats utveckling under fiskens livscykel, dissekera vi zebrafisk hjärtan på flera stadier och fotografera dem för vidare analys 11. Den morfologiska funktioner i hjärtat kan lätt kvantifieras och enskilda hjärtan kan analyseras ytterligare genom en mängd standardmetoder. Zebrafisk växa till rörlig ränta och mognad korrelerar bättre med fisk storlek än ålder, alltså efter fixering, vi fotograferar och mäta fisk längd som en mätare av fisk mognad. Detta protokoll förklarar två olika, storlek beroende dissektion tekniker för zebrafisk, allt från larver 3,5 mm standard längd (SL) med ett hjärta av 100μm ventrikeln längd (VL), för vuxna, med SL i 30mm och VL 1 mm eller större. Larver och vuxen fisk har helt olika kropp och orgel morfologi. Larver är inte bara betydligt mindre, de har mindre pigment och varje organ är visuellt mycket svårt att identifiera. Av denna anledning använder vi olika dissektion tekniker.
Vi använde före dissektion förfaranden fixering, eftersom vi upptäckt att hjärtan dissekeras direkt efter euthanization har en mer varierande morfologi, med mycket lös och ballong som förmak jämfört med hjärtan bort efter fixering. Fisken fasta före dissektion, behålla in vivo morfologi och kammare ställning (data visas inte). Dessutom, för demonstration tar vi nytta av hjärtat (hjärtinfarkt) särskilda GFP transgena Tg (myl7: GFP) twu34 (12), som tillåter oss att visualisera hela hjärtat och är särskilt användbart i tidiga stadier i utvecklingen när hjärt- morfologi är mindre skiljer sig från omgivande vävnader. Dissektion av hjärtat ger ytterligare analys av cell-och molekylärbiologi underliggande hjärt utveckling och mognad med in situ hybridisering, immunohistokemi, RNA-extraktion eller andra analysmetoder lättare i post-embryonal zebrafisk. Detta protokoll kommer att ge en värdefull teknik för att studera hjärtats utveckling mognad och åldrande.
Protocol
Discussion
Dessa metoder för dissekering av zebrafisk hjärtat av post-embryonala fisk möjliggör fullständig borttagning av ett oskadat hjärta. Även om denna teknik är enkel och ger riktlinjer för extern nedskärningar som förhindrar skador på hjärtat, är en stadig hand viktigt för mindre fiskar.
Ett viktigt steg under dissektionen är att identifiera de silverfärgade hjärtsäcken som hjärtat är direkt inom detta SAC. Visualisera hjärtsäck är en viktig markör för att hitta och slu…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Tack vare Marie Birne, Areti Tsiola, Jaymie Estevez och Arelys Uribe. Detta arbete stöddes delvis av CUNY Research Foundation och Howard Hughes Medical Institute Grant sommarskola för studenter (SPUR) och NIH RO3 41702-00-01. Forskning stöddes också av Queens College och några av experimenten gjordes på utrustning från Core Facility for Imaging, Cell-och molekylärbiologi vid Queens College.
Materials
| Material | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Paraformaldehyde | EMD | PX0055 | .04g/mL in PBS |
| Forceps #55 | FST | 11295-51 | |
| Micro-scissors | FST | 15005-08 | |
| Pin holder | FST | 26016-12 | |
| Micro-needles | FST | 10130-10 | |
| Nutrient Agar | BBL | 11472 | 23g/L in distilled H2O |
| Petri dishes | BD Falcon | 351029 | |
| PCR 8-tube strips | USA Scientific | 1402-2500 | |
| Digital Caliper | Fisher Scientific | 14-648-17 |
Riferimenti
- Ahmad, N., Long, S., Rebagliati, M. A southpaw joins the roster: the role of the zebrafish nodal-related gene southpaw in cardiac LR asymmetry. Trends Cardiovasc Med. 14, 43-49 (2004).
- Armstrong, E. J., Bischoff, J. Heart valve development: endothelial cell signaling and differentiation. Circ Res. 95, 459-470 (2004).
- Bakkers, J., Verhoeven, M. C., Abdelilah-Seyfried, S. Shaping the zebrafish heart: from left-right axis specification to epithelial tissue morphogenesis. Dev Biol. 330, 213-220 (2009).
- Glickman, N. S., Yelon, D. Cardiac development in zebrafish: coordination of form and function. Semin Cell Dev Biol. 13, 507-513 (2002).
- Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. Using the zebrafish model to study GATA transcription factors. Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).
- Schoenebeck, J. J., Yelon, D. Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics. Semin Cell Dev Biol. 18, 27-35 (2007).
- Beis, D. Genetic and cellular analyses of zebrafish atrioventricular cushion and valve development. Development. 132, 4193-4204 (2005).
- Lepilina, A. A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration. Cell. 127, 607-619 (2006).
- Wills, A. A., Holdway, J. E., Major, R. J., Poss, K. D. Regulated addition of new myocardial and epicardial cells fosters homeostatic cardiac growth and maintenance in adult zebrafish. Development. 135, 183-192 (2008).
- Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238, 2975-3015 (2009).
- Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish. Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , (1995).
