En enkel och bekväm metod för att fastställa omfattningen av gapet korsningen spårämne kopplingen mellan näthinnans nervceller beskrivs. Denna teknik möjliggör en för att undersöka funktionen hos de elektriska synapser mellan nervceller i den intakta näthinnan under olika belysning förhållanden och vid olika tider på dygnet.
Förutom kemisk synaptisk transmission kan nervceller som är sammankopplade genom gap junctions kommunicerar också snabbt via elektriska synaptisk transmission. Ökad tyder på att gap-junctions inte bara tillåter elektrisk ström flöde och synkrona aktivitet mellan sammankopplade eller kopplade celler, men att styrka eller effekt av elektrisk kommunikation mellan kopplade celler kan anpassas i stor utsträckning 1,2. Dessutom medger den stora inre diameter (~ 1,2 nm) av många kanaler gap junction inte bara elektrisk ström, men också spridning av intracellulära signalmolekyler och små metaboliter mellan sammankopplade celler, så att gap-junctions kan också medla metabola och kemisk kommunikation . Styrkan i gapet Junktional kommunikation mellan nervceller och dess modulering av signalsubstanser och andra faktorer kan studeras genom att samtidigt elektriskt inspelning från kopplade celler och genom att fastställa than omfattningen av spridningen av spårämne molekyler, som är klyftan korsningen genomsläppliga, men inte membranet genomsläppliga efter jontoforetiskt injektion i enstaka celler. Dock kan dessa förfaranden vara extremt svårt att utföra på nervceller med små somata i intakt nervvävnad.
Ett flertal studier på elektriska synapser och modulering av elektrisk kommunikation har genomförts i ryggradsdjur näthinnan, eftersom varje av de fem näthinnans neuron typer är elektriskt sammankopplade med gap junctions 3,4. Ökande bevis har visat att dygnsrytm (24-timmars) klockan i näthinnan och förändringar i ljus stimulering reglerar gap junction koppling 3-8. Till exempel har de senaste arbete visat att näthinnans dygnsrytm klockan minskar koppling gap junction mellan tappar och stavar celler fotoreceptor under dagen genom att öka dopamin D2-receptorn aktivering och dramatiskt ökar rod-cone koppling på natten genom att minska D2-receptorn aktiveras <sup> 7,8. Men inte bara dessa studier extremt svårt att utföra på nervceller med små somata i intakta neurala retinal vävnad, men det kan vara svårt att i tillräcklig utsträckning kontrollera belysningen förhållandena under elektrofysiologiska studier av enstaka näthinnans nervceller för att undvika ljusinducerad förändringar i gapet korsning konduktans.
Här presenterar vi en enkel metod för att bestämma omfattningen av gapet korsningen spårämne kopplingen mellan näthinnans nervceller under olika belysning förhållanden och vid olika tider på dygnet. Denna nedskärning laddning teknik är en modifiering av skrapa lastning 9-12, som är baserad på färg lastning och spridning via öppna kanaler gap junction. Skrapa lastning fungerar bra i odlade celler, men inte i tjocka skivor som intakta näthinnor. Snittet laddning Tekniken har använts för att studera fotoreceptor kopplingen intakt fisk och däggdjur näthinnor 7, 8,13, och kan användas för att studera kopplingen mellanandra retinal nervceller, som beskrivs här.
Cut-lastning metoden som beskrivs här är en nyttig och enkel teknik för att fastställa omfattningen av gapet korsningen spårämne kopplingen mellan näthinnans nervceller under olika belysning förhållanden och vid olika tider på dygnet. Fördelar med denna teknik är möjligheten att kvantifiera omfattningen av gapet korsningen spårämne kopplingen mellan nervceller i intakta näthinnan vävnaden under olika belysning villkor under dagen och natten och att göra det för kopplade nervceller som har liten diameter somata. Begränsningar av tekniken i studien av gap-junctions i intakt vävnad delas in i två generella kategorier. Första kan spårämne spridning genom öppna gap-junctions vara relativt svårt att observera på grund av a) den lilla diameter eller avgiften i samband med öppna kanaler och b) de relativa volymerna av kopplade cellens 1,14,15. Det är, spårämne diffusion från en liten cell till en större cell eller grupp av kopplade celler, kompared till spårämne diffusion från en större cell till en mindre cell, kan vara svårare att upptäcka på grund av spårämne utspädning. För det andra, under vissa fysiologiska förhållanden, kan omfattningen av spårämne diffusion genom gap junctions i intakt vävnad inte korrekt återspeglar styrkan i gapet Junktional konduktans på grund av skillnader i värmeledningsförmåga små elektriska strömförande joner, jämfört med permeabilitet relativt stora spårämne molekyler 1,14,15. I allmänhet visar tecken på spårämne koppling starkt närvaron av funktion, öppna kanaler gap junction, men under vissa fysiologiska förhållanden kan spårämne spridning inte inträffar eller observeras även om elektrofysiologiska inspelningar tyder på förekomsten av en fungerande, öppna gap junctions.
Det verkar troligt att cut-lastning tekniken kan också användas för att undersöka omfattningen av gapet korsningen spårämne kopplingen mellan nervceller i intakt vävnad från andra delar av centrala nervsystemetTEM.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av NIH bidrag EY005102 till SCM och EY018640 för HLR
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Tricaine methane sulfonate (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | 150 mg/L of buffered fish tank water |
Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | 2 g/kgloading dose |
Dual Tube Night Vision Goggle | Night Optics USA | D-221 | |
Filter Paper, Grade No. 4 | Whatman | 1004-090 | |
Fine Forceps, Dumont No. 5, Biologie, 11 cm long | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Fine Scissors, spring-loaded, 8 mm blade, straight | Fine Science Tools | 15025-10 | |
Neurobiotin | Vector | SP-1120 | 0.5% |
Streptavidin-conjugated Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | 2% |
Dextran rhodamine(high (> 10,000) MW) | Invitrogen | D1817 | 0.5% |
Vectashield mounting medium | Vector | H-1000 | |
Zeiss 510 META Laser Scanning Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
LSM-5 Image Browser 3,2,0,115 | Carl Zeiss, Inc. | ||
ImageJ Software | NIH | ||
OriginPro 8.0 | OriginLab Corp. |