Photolyse des composés en cage dans les cils olfactifs des neurones sensoriels
Summary
La photolyse de composés en cage permet la production d'une augmentation rapide et localisé dans la concentration de divers composés physiologiquement actifs. Ici, nous montrons comment obtenir des enregistrements de patch-clamp combinée avec la photolyse de l'AMPc en cage ou en cage Ca pour l'étude de la transduction olfactive chez la souris dissocié neurones sensoriels olfactifs.
Abstract
La photolyse de composés en cage permet la production d'une augmentation rapide et localisé dans la concentration de divers composés physiologiquement actifs 1. Caged composés sont des molécules composées physiologiquement inactive par une cage chimique qui peut être rompu par un éclair de lumière ultraviolette. Ici, nous montrons comment obtenir des enregistrements de patch-clamp combinée avec la photolyse de composés en cage pour l'étude de la transduction olfactive chez la souris dissocié neurones sensoriels olfactifs. Le processus de transduction olfactive (Figure 1) se déroule dans les cils olfactifs des neurones sensoriels, où se liant aux récepteurs odorants conduit à l'augmentation de l'AMPc qui ouvre des nucléotides cycliques-dépendants (CNG) des canaux 2. D'entrée de Ca par les canaux CNG active les canaux Cl Ca-activé. Nous montrons comment dissocier les neurones de l'épithélium olfactif de souris 3 et comment activer les canaux CNG ou Ca-Cl activé les canaux par photolyse de l'AMPc en cage en cage 4 ou 5 Ca </ Sup>. Nous utilisons une lampe flash 6,7 à appliquer clignote ultraviolets pour la région ciliaire à uncage AMPc ou Ca alors de patch-clamp enregistrements sont prises pour mesurer le courant dans la cellule entière voltage-clamp de configuration 8-11.
Protocol
Discussion
Photolyse de composés en cage combiné avec des enregistrements de patch-clamp est une technique utile pour obtenir des sauts rapides et locales de la concentration de molécules actives physiologiquement à l'intérieur et l'extérieur des cellules. Plusieurs types de composés1 cage ont été synthétisés, et cette technique peut être appliquée à divers types de cellules, y compris les cellules en culture exprimant les canaux ioniques qui peuvent être activées ou modulée par photolyse de certains des c…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Equipment | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Adapter module flash lamp to microscope | Rapp OptoElectronic | FlashCube 70 | |
| Air table | TMC | MICRO-g 63-534 | |
| Digitizer | Axon Instruments | Digidata 1322A | |
| Data Acquisition Software | Axon Instruments | pClamp 8 | |
| Data Analysis Software | WaveMetrics | Igor | |
| Mirror for adapter module | Rapp OptoElectronic | M70/100 | |
| Electrode holder | Axon Instruments | 1-HL-U | |
| Faraday’s cage | Custom made | ||
| Filter cube | Olympus | U-MWU | Excitation filter removed |
| Flash lamp | Rapp OptoElectronic | JML-C2 | |
| Forceps Dumont #55 | World Precision Instruments | 14099 | |
| Glass capillaries | World Precision Instruments | PG10165-4 | |
| Glass bottom dish | World Precision Instruments | FD35-100 | |
| Illuminator | Olympus | Highlight 3100 | |
| Inverted microscope | Olympus | IX70 | |
| Micromanipulators | Luigs & Neumann | SM I | |
| Micropipette Puller | Narishige | PP-830 | |
| Monitor | HesaVision | MTB-01 | |
| Neutral density filters | Omega Optical | varies | |
| Objective 100X | Zeiss | Fluar 440285 | Either Zeiss or Olympus |
| Objective 100X | Olympus | UPLFLN 100XOI2 | Either Zeiss or Olympus |
| Optical UV shortpass filter | Rapp OptoElectronic | SP400 | |
| Patch-clamp amplifier | Axon Instruments | Axopatch 200B | |
| Photo Diode Assembly | Rapp OptoElectronic | PDA | |
| Quartz light guide | Rapp OptoElectronic | varies | We use 600 μm diameter |
| Silver wire | World Precision Instruments | AGT1025 | |
| Silver ground pellet | Warner instruments | 64-1309 | |
| Xenon arc lamp | Rapp OptoElectronic | XBL-JML |
| Reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| BCMCM-caged cAMP | BioLog | B016 |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma | A8806 |
| CaCl2 standard solution 0.1 M | Fluka | 21059 |
| Caged Ca: DMNP-EDTA | Invitrogen | D6814 |
| Cysteine | Sigma | C9768 |
| Concanavalin A type V (ConA) | Sigma | C7275 |
| CsCl | Sigma | C4036 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| DNAse I | Sigma | D4527 |
| EDTA | Sigma | E9884 |
| EGTA | Sigma | E4378 |
| Glucose | Sigma | G5767 |
| HEPES | Sigma | H3375 |
| KCl | Sigma | P3911 |
| KOH | Sigma | P1767 |
| Leupeptin | Sigma | L0649 |
| MgCl2 | Fluka | 63020 |
| Papain | Sigma | P3125 |
| Poly-L-lysine | Sigma | P1274 |
| NaCl | Sigma | S9888 |
| NaOH | Sigma | S5881 |
| NaPyruvate | Sigma | P2256 |
Riferimenti
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