Carcinoma associato fibroblasti (CAF), ricco di miofibroblasti presenti nello stroma del tumore, svolgono un ruolo importante nel guidare la progressione del tumore. Abbiamo sviluppato un tumore modello coimplantation xengraft per generare sperimentalmente CAF da fibroblasti umani mammaria. Il protocollo descrive come stabilire miofibroblasti CAF che acquisiscono la capacità di promuovere la tumorigenesi.
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Articolo metodologico
Generazione sperimentale di carcinoma-Associated fibroblasti (CAF) da fibroblasti umani mammari
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
I carcinomi sono i tessuti complesso composto di cellule neoplastiche e non-cancerosa comparto denominato 'stroma'. Lo stroma è costituito da matrice extracellulare (ECM) e una varietà di cellule mesenchimali, tra cui fibroblasti, miofibroblasti, cellule endoteliali, periciti e leucociti 1-3.
Il tumore-associati stroma è sensibile a sostanziali segnali paracrini rilasciati da cellule di carcinoma vicine. Durante il processo della malattia, lo stroma diventa spesso popolato da carcinoma associato fibroblasti (CAF), tra cui un gran numero di miofibroblasti. Queste cellule sono stati precedentemente estratti da diversi tipi di carcinomi umani per la loro cultura in vitro. Una sottopopolazione di CAF si distingue attraverso la loro up-regulation di α-actina del muscolo liscio (α-SMA) espressione 4,5. Queste cellule sono un marchio di garanzia 'fibroblasti attivati' che condividono proprietà similari con miofibroblasti commonly osservato nei tessuti fibrotici feriti e 6. La presenza di questo sottoinsieme myofibroblastic CAF è fortemente legate ad alto grado di malignità e associata a prognosi non favorevole nei pazienti.
Molti laboratori, compreso il nostro, hanno dimostrato che la CAF, una volta iniettato con cellule di carcinoma in topi immunodeficienti, sono in grado di promuovere sostanzialmente tumorigenesi 7-10. CAF preparato da pazienti carcinoma, però, frequentemente sottoposti a senescenza durante la propagazione della cultura limitare la vastità del loro utilizzo per tutta la sperimentazione in corso. Per superare questa difficoltà, abbiamo sviluppato una nuova tecnica per generare sperimentalmente immortalato umano mammario linee cellulari CAF (exp-CAF) da fibroblasti umani mammari, utilizzando un modello di tumore al seno coimplantation xenotrapianto.
Al fine di generare exp-CAF, dei genitori fibroblasti umani mammari, ottenute dal tessuto mastoplastica riduttiva, sono stati Immortalised con hTERT, la subunità catalitica della telomerasi oloenzima, e progettato per esprimere la GFP e un gene di resistenza puromicina. Queste cellule sono state coimplanted con cellule MCF-7 di carcinoma mammario umano esprime un oncogene attivato ras (MCF-7-ras cellule) in caso di trapianto di mouse. Dopo un periodo di incubazione in vivo, inizialmente iniettato fibroblasti umani mammari sono stati estratti dal xenotrapianti tumorali sulla base della loro resistenza puromicina 11.
Abbiamo osservato che il residente fibroblasti umani mammari hanno differenziato, l'adozione di un fenotipo tumorale myofibroblastic e acquisiti di promozione proprietà nel corso della progressione del tumore. È importante sottolineare che queste cellule, definite come exp-CAF, in stretta imitare il tumore di promozione fenotipo myofibroblastic del CAF isolate da carcinomi del seno sezionato dai pazienti. Il nostro tumore xenotrapianto-derivato exp-CAF quindi fornire un modello efficace per studiare la biologia del CAF in BREAS umanot carcinomi. Il protocollo descritto può essere esteso anche per la generazione e la caratterizzazione varie popolazioni CAF derivate da altri tipi di carcinomi umani.
Protocollo
1. Isolamento di fibroblasti umani in coltura primaria mammaria normale
Procedure sperimentali per isolare fibroblasti umani in coltura primaria mammaria normale, sono illustrate nella fig. 1A.
- Preparare il tampone di cellule dissociazione, come descritto in precedenza 12: Media Dulbecco Modified Eagle (DMEM) con 10% di siero fetale bovino (FCS), penicillina-streptomicina (200 unità / ml), collagenasi di tipo I (1 mg / ml) e ialuronidasi ( 125 unità / ml).
- Lavare il tessuto del seno sezionato da una mastoplastica riduttiva (~ 0,5 grammi), più volte in tampone fosfato (PBS). Tritare il tessuto in piccoli fra....
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Discussione
La mancanza di CAF-specifici marcatori e il livello di eterogeneità osservata tra CAF rendere la caratterizzazione di questo tipo di cellule una sfida in sé. CAF studio in vitro è stato ostacolato dalla complicazione ulteriore che queste cellule senesce e fermare la proliferazione quando in coltura per un lungo periodo. Il nostro precedente tentativo di immortalare direttamente CAF primaria utilizzando un costrutto retrovirale hTERT cDNA non ha avuto successo. Pertanto, per approfondire lo studio del tumore di .......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Ringraziamo il Dr. Robert A. Weinberg (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge) per il generoso sostegno e la supervisione di questo lavoro e il Sig. Kieran Mellody (Università di Manchester, Manchester) per la modifica critica di questo manoscritto. Questo progetto è stato sostenuto da Research UK (CR-UK) concedere numero C147/A6058 (AO)
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome del materiale | Tipo | Azienda | Numero di catalogo | Commento |
| DMEM | Invitrogen | 61965-026 | ||
| Siero di vitello fetale | GIBCO | 10270 | ||
| Penicillina-streptomicina | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Collagenasi tipo I | Sigma | C0130-1G | ||
| ialuronidasi | Sigma | H4272 | ||
| Vimentina (V9) anticorpi | Novocastra Laboratori | NCL-L- VIM-V9 | ||
| Tenascina C (AC-8) anticorpi | un dono di | |||
| α-SMA-Cy3 (1A4) anticorpi | Sigma | C6198 | ||
Prolil-4-idrossilasi | Dako | M0877 | ||
| (5B5) anticorpi | ||||
| Collagene tipo1 1A anticorpi | Sigma | HPA011795 | ||
| Pan-citocheratina anticorpi | Sigma | C5992 | ||
| Anticorpi fibronectina | BD Biosciences | 610077 | ||
S100A4/FSP-1 (fibroblasti- proteina-1 specifica) degli anticorpi | Dako | A5114 | ||
Fibroblasti superficie proteica (Clone 1B10) anticorpi | Abcam | ab11333 | ||
| MSCV-IRES-GFP costruire | Richiesta ai autori | |||
| pBabe-puro costruire | Acquisto da Addgene | |||
| Puromicina | Sigma | P8833 | ||
| DAPI | Sigma | D9564 | ||
| Tubo 15 ml conica | Corning | 430766 | ||
| Topo nudo | Taconic | NCRNU-F | NCR nudo femminile | |
| C3H/10T1/2 cellule | ATCC | CCL-226 |
Riferimenti
- Ronnov-Jessen, L., Bissell, M. J. Breast cancer by proxy: can the microenvironment be both the cause and consequence? Trends Mol. Med. 15, 5-13 (2009).
- Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Na....
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Ristampe e permessi
