Experimentelle Erzeugung von Karzinom-assoziierte Fibroblasten (CAF) von menschlichen Brustkrebszellen Fibroblasten
Summary
Karzinom-assoziierte Fibroblasten (CAF) reichen in Myofibroblasten innerhalb des Tumorstroma, spielen eine wichtige Rolle bei der Vertreibung der Tumorprogression. Wir entwickelten ein coimplantation Tumor xengraft Modell für experimentell erzeugen CAF von der menschlichen Brustdrüse Fibroblasten. Das Protokoll beschreibt, wie CAF Myofibroblasten, dass die Fähigkeit zur Tumorentstehung fördern erwerben zu etablieren.
Abstract
Karzinome sind komplexe Gewebe von neoplastischen Zellen und einer nicht krebsartigen Fach bezeichnet als "Stroma" zusammen. Das Stroma besteht aus der extrazellulären Matrix (ECM) und eine Vielzahl von mesenchymalen Zellen, einschließlich Fibroblasten, Myofibroblasten, Endothelzellen, Perizyten und Leukozyten 1-3.
Der Tumor-assoziierten Stroma reagiert auf erhebliche parakrine Signale von benachbarten Krebszellen freigesetzt. Während des Krankheitsverlaufs, das Stroma wird oft von Karzinom-assoziierte Fibroblasten (CAF), einschließlich einer großen Anzahl von Myofibroblasten besiedelt. Diese Zellen haben bisher von vielen verschiedenen Arten von humanen Karzinomen wurden für ihre in-vitro-Kultur extrahiert. Eine Subpopulation von CAF unterscheidet sich durch ihre Hochregulation von α-smooth muscle actin (α-SMA) Ausdruck 4,5. Diese Zellen sind ein Markenzeichen der "aktivierten Fibroblasten", die ähnliche Eigenschaften teilen mit Myofibroblasten commonly in verletzten und fibrotische Gewebe 6 beobachtet. Das Vorhandensein dieser myofibroblastischer CAF Teilmenge ist sehr zu hochwertigen Malignomen im Zusammenhang und in Verbindung mit schlechten Prognosen bei Patienten.
Viele Laboratorien, einschließlich unserer eigenen, haben gezeigt, dass CAF, wenn sie mit Karzinom-Zellen in immundefizienten Mäusen injiziert, der fähig ist wesentlich fördern Tumorgenese 7-10 sind. CAF von Karzinom-Patienten vorbereitet, jedoch häufig zu unterziehen Seneszenz bei der Ausbreitung in der Kultur Begrenzung des Umfangs ihres Einsatzes im gesamten laufenden Experimente. Zur Überwindung dieser Schwierigkeit, entwickelten wir eine neuartige Technik experimentell zu erzeugen immortalisierten humanen Mamma-CAF-Zelllinien (exp-CAF) aus menschlichen Brustkrebszellen Fibroblasten mit einem coimplantation Brusttumor Xenograftmodell.
Um exp-CAF, Kindersicherung menschlichen Brustdrüse Fibroblasten, aus der Reduktion mammoplasty Gewebe gewonnen zu generieren, wurden zuerst immortalised mit hTERT, der katalytischen Untereinheit der Telomerase Holoenzym, und ausgeführt, um auszudrücken GFP und ein Puromycin-Resistenzgen. Diese Zellen wurden mit humanen MCF-7 Brustkrebs-Zellen, die einen aktivierten Ras-Onkogen (MCF-7-ras-Zellen) in eine Maus-Xenograft coimplanted. Nach einer Inkubationszeit in vivo wurden die ursprünglich injizierten menschlichen Brustdrüse Fibroblasten aus dem Tumorxenotransplantaten auf der Grundlage ihrer Puromycin-Resistenz 11 entnommen.
Wir beobachten, dass die Bewohner menschlichen Brustdrüse Fibroblasten differenziert, die Annahme eines myofibroblastischer Phänotyp und erwarb Tumor-fördernden Eigenschaften im Laufe der Tumorprogression. Wichtig ist, dass diese Zellen, definiert als exp-CAF, imitieren tumorpromovierende myofibroblastischer Phänotyp der CAF von Mammakarzinomen von Patienten seziert isoliert. Unsere Tumorxenotransplantates-derived exp-CAF daher ein wirksames Modell, um die Biologie des CAF in menschlichen Breas Studiet Karzinome. Das beschriebene Protokoll kann auch zur Erzeugung und Charakterisierung von verschiedenen CAF Populationen von anderen Typen von humanen Karzinomen abgeleitet erweitert werden.
Protocol
Discussion
Das Fehlen von CAF-spezifischen Markern und das Niveau der Heterogenität beobachtet unter CAF die Charakterisierung dieses Zelltyps eine Herausforderung an sich zu machen. Studieren CAF in vitro wurde auch durch die zusätzliche Komplikation verhindert worden, dass diese Zellen und senesce stoppen proliferierenden, wenn über einen längeren Zeitraum kultiviert. Unsere erste Anlauf, direkt verewigen primäre CAF mit einem retroviralen hTERT cDNA-Konstrukt war nicht erfolgreich. Deshalb zur weiteren Untersuchun…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Robert A. Weinberg (Whitehead Institute for Biomedical Research, Cambridge) für die großzügige Unterstützung und Betreuung dieser Arbeit und Herrn Kieran Mellody (University of Manchester, Manchester) für kritische Bearbeitung des Manuskripts. Dieses Projekt wurde von Research UK (CR-UK) Grant-Nummer C147/A6058 (AO) unterstützt
Materials
| Material Name | Tipo | Company | Catalogue Number | Comment |
| DMEM | Invitrogen | 61965-026 | ||
| Fetal calf serum | GIBCO | 10270 | ||
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | ||
| Collagenase type I | Sigma | C0130-1G | ||
| hyaluronidase | Sigma | H4272 | ||
| Vimentin (V9) antibody | Novocastra Laboratories | NCL-L- VIM-V9 |
||
| Tenascin C (BC-8) antibody | a gift from |
|||
| α-SMA-Cy3 (1A4) antibody | Sigma | C6198 | ||
Prolyl-4-hydroxylase |
Dako | M0877 | ||
| (5B5) antibody | ||||
| Collagen type1 1A antibody | Sigma | HPA011795 | ||
| Pan-cytokeratin antibody | Sigma | C5992 | ||
| Fibronectin antibody | BD Biosciences | 610077 | ||
S100A4/FSP-1 (fibroblast- specific protein-1) antibody |
Dako | A5114 | ||
Fibroblast surface protein (clone 1B10) antibody |
Abcam | ab11333 | ||
| MSCV-IRES-GFP construct | Request to the the authors | |||
| pBabe-puro construct | Purchase from Addgene |
|||
| Puromycin | Sigma | P8833 | ||
| DAPI | Sigma | D9564 | ||
| 15 ml conical tube | Corning | 430766 | ||
| Nude mouse | Taconic | NCRNU-F | Female NCr nude | |
| C3H/10T1/2 cells | ATCC | CCL-226 |
Riferimenti
- Ronnov-Jessen, L., Bissell, M. J. Breast cancer by proxy: can the microenvironment be both the cause and consequence?. Trends Mol. Med. 15, 5-13 (2009).
- Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes – bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nat. Rev. Cancer. 4, 839-849 (2004).
- Bhowmick, N. A., Neilson, E. G., Moses, H. L. Stromal fibroblasts in cancer initiation and progression. Nature. 432, 332-337 (2004).
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Fibroblasts in cancer. Nat. Rev. Cancer. 6, 392-401 (2006).
- De Wever, O. Tenascin-C and SF/HGF produced by myofibroblasts in vitro provide convergent pro-invasive signals to human colon cancer cells through RhoA and Rac. 18, 1016-1018 (2004).
- Serini, G., Gabbiani, G. Mechanisms of myofibroblast activity and phenotypic modulation. Exp. Cell. Res. 250, 273-283 (1999).
- Shimoda, M., Mellody, K. T., Orimo, A. Carcinoma-associated fibroblasts are a rate-limiting determinant for tumour progression. Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 19-25 (2010).
- Pietras, K., Ostman, A. Hallmarks of cancer: interactions with the tumor stroma. Exp. Cell. Res. 316, 1324-1331 (2010).
- Polyak, K., Haviv, I., Campbell, I. G. Co-evolution of tumor cells and their microenvironment. Trends in Genetics. 25, 30-38 (2009).
- Franco, O. E., Shaw, A. K., Strand, D. W., Hayward, S. W. Cancer associated fibroblasts in cancer pathogenesis. Semin. Cell. Dev. Biol. 21, 33-39 (2010).
- Kojima, Y. Autocrine TGF-beta and stromal cell-derived factor-1 (SDF-1) signaling drives the evolution of tumor-promoting mammary stromal myofibroblasts. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 20009-20014 (2010).
- Orimo, A. Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell. 121, 335-348 (2005).
