Chromatografisk Rensning af højaktiv Gær ribosomer
Summary
Forurening af præparater af eukaryote ribosomer renses ved traditionelle metoder ved co-rensende nucleaser og proteaser negativt virkninger på downstream-biokemiske og strukturelle analyser. En hurtig og enkel kromatografisk oprensning metoden anvendes til at løse dette problem ved hjælp af gær ribosomer som model system.
Abstract
Eukaryote ribosomer er meget mere labile i forhold til deres eubacterial og archael modstykker, og udgør derfor en stor udfordring for forskerne. Særligt generende er, at lyse af celler frigiver en lang række proteaser og nucleaser som kan forringe ribosomer. Derfor er det vigtigt at adskille ribosomer fra disse enzymer så hurtigt som muligt. Desværre, konventionelle forskellen ultracentrifugering metoder blade ribosomer udsat for disse enzymer til uacceptabelt lange perioder, påvirker deres strukturelle integritet og funktionalitet. For at løse dette problem, vi benytter en kromatografisk metode ved hjælp af en cystein opkrævet Sulfolink harpiks. Denne enkle og hurtige anvendelse reducerer co-rensende proteolytiske og nucleolytic aktiviteter, der producerer høje udbytter af intakt, meget biokemisk aktiv gær ribosomer. Vi foreslår, at denne metode også bør gælde for pattedyr ribosomer. Den enkelhedmetoden, og de forbedrede renhed og aktivitet chromatografisk renset ribosom repræsenterer et betydeligt teknisk fremskridt for studiet af eukaryote ribosomer.
Protocol
Discussion
Ribosom rensning protokoller hovedsagelig tale lysering celler, høst et cytosol fraktion fra en lav hastighed spin, og derefter pelletering ribosomer ved høj hastighed centrifugering 1. Mens et par nye metoder har været brugt til rensning af bakterielle ribosomer, havde det samme ikke været tilfældet for eukaryoter 2-4. Selv om yderligere skridt er blevet tilføjet langs år, fx salt vasker, og glycerol hynder (se f.eks 5), har biokemiske og strukturelle studier af gær ribosomer bl…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker at takke alle medlemmerne af Dinman laboratoriet, herunder Ashton Belew, Karen Jack, Sharmishtha Musalga, Sergey Sulima, Shivani Reddy, og Michael Rhodin for deres hjælp og input på dette projekt. Dette arbejde blev støttet af tilskud til AM fra American Heart Association (AHA 0630163N) og JDD fra National Institutes of Health (5R01 GM058859-12). JAL blev understøttet af en amerikansk Reinvestering og Recovery Act of 2009 supplement til den forælder, tilskud (3R01GM058859-11S1).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Sulfolink Coupling resin | Pierce | 20402 |
| Mini bead-beater 16 | Biospec | 607 |
| Optima Max E ultracentrifuge | Beckman Coulter | |
| Legend RT | Sorvall | |
| 0.5 mm Glass beads | Biospec | 11079105 |
| Tris | Sigma-Aldrich | 252859 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43815 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54459 |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661 |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P7255 |
| GTP | Fermentas | R0461 |
Riferimenti
- Palade, G. E., Siekevitz, P. Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).
- Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).
- Jelenc, P. C. Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli. Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).
- Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns. Biochimie. 62, 69-77 (1980).
- Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis. Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).
- Algire, M. A. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
- Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria. RNA. 14, 188-195 (2008).
- Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method. RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).
- Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites. Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).
- Nathans, D. Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).
- Rabinovitz, M., Fisher, J. M. A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells. J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).
- Allen, D. W., Zamecnik, P. C. The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).
- Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).
- Becker-Ursic, D., Davies, J. In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae. Biochimica. 15, 2289-2296 (1976).
