अति सक्रिय खमीर Ribosomes के chromatographic शोधन
Summary
यूकेरियोटिक सह शुद्ध न्युक्लिअसिज़ और proteases द्वारा परंपरागत तरीके से शुद्ध ribosomes की तैयारी के संदूषण के बहाव के जैव रासायनिक और संरचनात्मक विश्लेषण पर नकारात्मक प्रभाव डालता है. एक तेजी से और सरल chromatographic शुद्धि की विधि के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में खमीर ribosomes का उपयोग कर इस समस्या को हल करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
Abstract
यूकेरियोटिक ribosomes अधिक अस्थिर कर रहे हैं के रूप में उनके eubacterial और archael समकक्षों की तुलना में, इस प्रकार शोधकर्ताओं के लिए एक महत्वपूर्ण चुनौती प्रस्तुत. विशेष रूप से तथ्य यह है कि कोशिकाओं के lysis proteases और न्युक्लिअसिज़ जो ribosomes नीचा कर सकते हैं की एक बड़ी संख्या विज्ञप्ति परेशानी है. इस प्रकार, यह महत्वपूर्ण है इन एंजाइमों से ribosomes के रूप में जल्दी संभव के रूप में अलग. दुर्भाग्य से, परंपरागत अंतर ultracentrifugation तरीकों unacceptably समय की लंबी अवधि के लिए इन एंजाइमों को उजागर ribosomes पत्ते, उनकी संरचनात्मक अखंडता और कार्यक्षमता को प्रभावित है. इस समस्या का समाधान करने के लिए, हम एक chromatographic चार्ज सिस्टीन Sulfolink राल का उपयोग विधि का उपयोग. यह सरल और तेजी से आवेदन काफी proteolytic सह शुद्ध और nucleolytic गतिविधियों, बरकरार है, अत्यधिक biochemically सक्रिय खमीर ribosomes की उच्च पैदावार उत्पादन कम कर देता है. हम सुझाव है कि इस विधि भी स्तनधारी ribosomes के लिए लागू किया जाना चाहिए. की सादगीविधि, और बढ़ाया और chromatographically शुद्ध ribosome की पवित्रता गतिविधि यूकेरियोटिक ribosomes के अध्ययन के लिए एक महत्वपूर्ण तकनीकी उन्नति का प्रतिनिधित्व करता है.
Protocol
Discussion
Ribosome शुद्धि प्रोटोकॉल मूल रूप से lysing कोशिकाओं शामिल है, एक कम गति स्पिन से एक साइटोसोलिक अंश संचयन, और फिर उच्च गति 1 centrifugation द्वारा ribosomes pelleting. जबकि कुछ तरीकों उपन्यास बैक्टीरियल ribosomes सफ़ाई के लिए इस्तेमाल क…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम Dinman प्रयोगशाला के सदस्यों एस्टन Belew, करेन जैक, शर्मिष्ठा Musalga, सेर्गेई Sulima, शिवानी रेड्डी, और उनकी मदद और इस परियोजना पर निवेश के लिए माइकल Rhodin सहित सभी का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं. इस काम अनुदान द्वारा समर्थित किया गया अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (अहा 0630163N) से AM और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (5R01 GM058859-12) से JDD. जल एक अमेरिकी पुनर्निवेश और वसूली अधिनियम 2009 के पूरक के मूल अनुदान के लिए (3R01GM058859-11S1) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Sulfolink Coupling resin | Pierce | 20402 |
| Mini bead-beater 16 | Biospec | 607 |
| Optima Max E ultracentrifuge | Beckman Coulter | |
| Legend RT | Sorvall | |
| 0.5 mm Glass beads | Biospec | 11079105 |
| Tris | Sigma-Aldrich | 252859 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 |
| DTT | Sigma-Aldrich | 43815 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 54459 |
| NH4Cl | Sigma-Aldrich | A9434 |
| KCl | Sigma-Aldrich | 60128 |
| Mg(OAc)2 | Sigma-Aldrich | M5661 |
| KOH | Sigma-Aldrich | 221473 |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 |
| Puromycin | Sigma-Aldrich | P7255 |
| GTP | Fermentas | R0461 |
Riferimenti
- Palade, G. E., Siekevitz, P. Liver microsomes; an integrated morphological and biochemical study. J. Biophys. Biochem. Cytol. 2, 171-200 (1956).
- Fabry, M., Kalvoda, L., Rychlik, I. Hydrophobic interactions of Escherichia coli ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 652, 139-150 (1981).
- Jelenc, P. C. Rapid purification of highly active ribosomes from Escherichia coli. Anal. Biochem. 105, 369-374 (1980).
- Le goffic, F., Moreau, N., Chevelot, L., Langrene, S., Siegrist, S. Purification of bacterial ribosomes using chloramphenicol and erythromycin columns. Biochimie. 62, 69-77 (1980).
- Meskauskas, A., Petrov, A. N., Dinman, J. D. Identification of functionally important amino acids of ribosomal protein L3 by saturation mutagenesis. Mol. Cell Biol. 25, 10863-10874 (2005).
- Algire, M. A. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
- Maguire, B. A., Wondrack, L. M., Contillo, L. G., Xu, Z. A novel chromatography system to isolate active ribosomes from pathogenic bacteria. RNA. 14, 188-195 (2008).
- Leshin, J. A., Rakauskaite, R., Dinman, J. D., Meskauskas, A. Enhanced purity, activity and structural integrity of yeast ribosomes purified using a general chromatographic method. RNA. Biol. 7, 354-360 (2010).
- Triana, F., Nierhaus, K. H., Chakraburtty, K. Transfer RNA binding to 80S ribosomes from yeast: evidence for three sites. Biochem. Mol. Biol. Int. 33, 909-915 (1994).
- Azzam, M. E., Algranati, I. D. Mechanism of puromycin action: fate of ribosomes after release of nascent protein chains from polysomes. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 70, 3866-3869 (1973).
- Nathans, D. Puromuycin inhibition of protein synthesis: incorporation of puromycin into peptide chains. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 51, 585-592 (1964).
- Rabinovitz, M., Fisher, J. M. A dissociative effect of puromycin on the pathway of protein synthesis by Ehrlich ascites tumor cells. J. Biol. Chem. 237, 477-481 (1962).
- Allen, D. W., Zamecnik, P. C. The effect of puromycin on rabbit reticulocyte ribosomes. Biochim. Biophys. Acta. 55, 865-874 (1962).
- Yarmolinsky, M. B., Haba, G. L. Inhibition by puromycin of amino acid incorporation into protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 45, 1721-1729 (1959).
- Becker-Ursic, D., Davies, J. In vivo and in vitro phosphorylation of ribosomal proteins by protein kinases from Saccharomyces cerevisiae. Biochimica. 15, 2289-2296 (1976).
