इमेजिंग ल्युकोसैट उच्च Intraluminal दबाव में संवहनी endothelium के लिए आसंजन
Summary
यह एक विधि काटा दबाव वाहिकाओं में endothelium के लिए ल्युकोसैट आसंजन कल्पना है. तकनीक कतरनी प्रवाह के तहत intraluminal दबाव भिन्न 200 mmHg इस प्रकार उच्च रक्तचाप के pathophysiological शर्तों नकल – आईएनजी के साथ संवहनी आसंजन का अध्ययन सक्षम बनाता है.
Abstract
Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. In the vasculature hypertension is associated with endothelial dysfunction and increased inflammation leading to atherosclerosis and various disease states such as chronic kidney disease2, stroke3 and heart failure4. An initial step in vascular inflammation leading to atherogenesis is the adhesion cascade which involves the rolling, tethering, adherence and subsequent transmigration of leukocytes through the endothelium. Recruitment and accumulation of leukocytes to the endothelium is mediated by an upregulation of adhesion molecules such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and E-selectin as well as increases in cytokine and chemokine release and an upregulation of reactive oxygen species5. In vitro methods such as static adhesion assays help to determine mechanisms involved in cell-to-cell adhesion as well as the analysis of cell adhesion molecules. Methods employed in previous in vitro studies have demonstrated that acute increases in pressure on the endothelium can lead to monocyte adhesion, an upregulation of adhesion molecules and inflammatory markers6 however, similar to many in vitro assays, these findings have not been performed in real time under physiological flow conditions, nor with whole blood. Therefore, in vivo assays are increasingly utilised in animal models to demonstrate vascular inflammation and plaque development. Intravital microscopy is now widely used to assess leukocyte adhesion, rolling, migration and transmigration7-9. When combining the effects of pressure on leukocyte to endothelial adhesion the in vivo studies are less extensive. One such study examines the real time effects of flow and shear on arterial growth and remodelling but inflammatory markers were only assessed via immunohistochemistry10. Here we present a model for recording leukocyte adhesion in real time in intact pressurised blood vessels using whole blood perfusion. The methodology is a modification of an ex vivo vessel chamber perfusion model9 which enables real-time analysis of leukocyte -endothelial adhesive interactions in intact vessels. Our modification enables the manipulation of the intraluminal pressure up to 200 mmHg allowing for study not only under physiological flow conditions but also pressure conditions. While pressure myography systems have been previously demonstrated to observe vessel wall and lumen diameter11 as well as vessel contraction this is the first time demonstrating leukocyte-endothelial interactions in real time. Here we demonstrate the technique using carotid arteries harvested from rats and cannulated to a custom-made flow chamber coupled to a fluorescent microscope. The vessel chamber is equipped with a large bottom coverglass allowing a large diameter objective lens with short working distance to image the vessel. Furthermore, selected agonist and/or antagonists can be utilized to further investigate the mechanisms controlling cell adhesion. Advantages of this method over intravital microscopy include no involvement of invasive surgery and therefore a higher throughput can be obtained. This method also enables the use of localised inhibitor treatment to the desired vessel whereas intravital only enables systemic inhibitor treatment.
Protocol
Discussion
यह एक संशोधित बरकरार वास्तविक समय में दबाव की शर्तों के तहत अलग रक्त वाहिकाओं में endothelium ल्युकोसैट आसंजन अध्ययन विधि है. अकेले पोत चैम्बर के छिड़काव बड़े चूहों और चूहे वाहिकाओं के समर्थक भड़काऊ उपभेदों के एक त्वरित सत्यापन के लिए सक्षम बनाता है. सक्षम करने से दबाव हेरफेर गतिशील सेल बातचीत बहुत उच्च intraluminal दबाव है, इस प्रकार बेहतर नकल रही शारीरिक और pathophysiological शर्तों को कम से मनाया अनुमति देता है. जहाजों के व्यास भी पर्याप्त सेल इमेजिंग प्रोग्राम का उपयोग और इसलिए कतरनी प्रवाह और दर और निर्धारित किया जा सकता है इसलिए चालाकी से मापा जा सकता है.
अपनी myograph क्षमताओं के साथ, औषधीय स्नान में रखा हस्तक्षेप इस मॉडल यंत्रवत और संकेत रास्ते के अध्ययन को सक्षम करने के साथ प्रयोगात्मक संभव स्थिति के लिए एक और आयाम जोड़. जबकि endothelial संरक्षण दबाव हेरफेर के दौरान पुष्टि नहीं हो सकते हैं, ACH और पीई के लिए प्रतिक्रियाओं के बाद 9 छिड़काव आयोजित किया जा सकता है.
यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस सेटअप सेल के लिए सेल काँपने के गुणवाला रक्त प्रवाह और न ही सिस्टोलिक या diastolic दबाव के प्रभाव नहीं बातचीत पर intraluminal दबाव के प्रभाव को दर्शाता है. इसके अलावा, जबकि ल्युकोसैट आसंजन पर तीव्र दबाव परिवर्तन मनाया गया, इस सेटअप भी हो सकता है पुरानी दबाव प्रभाव (यानी ऊष्मायन बार बढ़ती है और एक पुरानी दबाव पशु मॉडल का उपयोग) को देखने का उपयोग कर सकते हैं. Sprague Dawley आम मन्या धमनियों इस सेट में प्रदर्शन कर रहे हैं, लेकिन अन्य उपभेदों और प्रजातियों प्रवेशनी आकार के लिए उपयुक्त समायोजन के साथ इस्तेमाल किया जा सकता है. वास्तव में, यह नोट करना महत्वपूर्ण है कि और जानवरों की उम्र और वजन पोत आकार को प्रभावित और इस तरह है कि सेट अप के लिए प्रत्येक पोत के लिए व्यक्तिगत की जरूरत है. संयोजी ऊतक के बंद और सावधान विच्छेदन leukocytes के दृश्य काफी सुधार कर सकते हैं.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन में भाग विक्टोरियन है सरकार OIS कार्यक्रम, राष्ट्रीय स्वास्थ्य और ऑस्ट्रेलिया कार्यक्रम और परियोजना अनुदान के चिकित्सा अनुसंधान परिषद (JPF ठोकरें – चिन) और स्नातकोत्तर छात्रवृत्ति (डी मिचेल) द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Microscope | Carl Zeiss, Inc | SteREO Discovery V.20 | |
| PHD 2000 Syringe Pump | Harvard Apparatus | 70-2016 | |
| Digital Camera and Controller | Hamamatsu ORCA-ER | C4742-95 | |
| Fluorescence Illumination System | Lumen Dynamics | X-Cite 120 | |
| Vessel Chamber | Living Systems Instrumentation | CH/1/SH | |
| Pressure Servo Controller and Peristaltic Pump | Living Systems Instrumentation | PS – 200 | |
| Perfusion Pressure Monitor | Living Systems Instrumentation | PM – 4 | |
| 2 x Pressure Transducer | Living Systems Instrumentation | PT – F | |
| Temperature Controller | Living Systems Instrumentation | TC-01 | |
| Peristaltic Pump | Instech Laboratories, Inc | P720 | |
| VybrantDil cell-labelling solution | Invitrogen | V-22885 | Use 1:1000 |
Riferimenti
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