Aplicação de um rato ligado patch Peyer Assay alça intestinal para avaliar absorção pelas células bacterianas M
Summary
Células M em um epitélio folículo-associados especializados que cobrem as placas de Peyer desempenhar um papel importante para a vigilância imunológica da mucosa intestinal em tecido linfóide associado. Aqui descrevemos o método de avaliação para transcitose bacteriana por células M<em> In vivo</em>. Este método proporciona um método para compreender a função das células M no sistema imunológico.
Abstract
O interior do nosso intestino é habitado, com grande número de bactérias comensais. A superfície da mucosa do trato gastrointestinal é constantemente exposta a eles e, ocasionalmente, a patógenos. O tecido linfóide associado ao intestino (GALT) desempenham um papel fundamental para a indução da resposta imune da mucosa a estes micróbios 1, 2. Para iniciar a resposta imune da mucosa, os antígenos da mucosa devem ser transportados a partir da luz intestinal através da barreira epitelial em folículos linfóides organizados, tais como placas de Peyer. Este transcitose antígeno é mediada por células especializadas M epiteliais 3, 4. As células M são atípicos células epiteliais que fagocitam ativamente macromoléculas e micróbios. Ao contrário das células dendríticas (DCs) e macrófagos, antígenos que têm como alvo a lisossomos para degradação, as células M transcytose principalmente os antígenos internalizado. Este transcitose macromolecular vigorosa através de células M oferece antígeno ao subjacente organizado folículos linfóides umd acredita-se ser essencial para dar início antígeno específico da mucosa respostas imunes. No entanto, os mecanismos moleculares promover esta absorção de antígenos por células M são em grande parte desconhecido. Temos relatado anteriormente que glicoproteína 2 (GP2), especificamente expressos na membrana plasmática apical das células M entre os enterócitos, serve como um receptor transcytotic para um subconjunto de comensais e patogênicos enterobactérias, incluindo Escherichia coli e Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium ), ao reconhecer FimH, um componente do tipo I pili na membrana externa bacteriana 5. Aqui, apresentamos um método para a aplicação de um ensaio de Peyer rato ciclo de patch para avaliar a absorção intestinal de bactérias pelas células M. Este método é uma versão melhorada do ensaio de loop do mouse intestinal descrito anteriormente 6, 7. Os pontos de melhoria são as seguintes: 1. Isoflurano foi usado como um agente anestésico. 2. Aproximadamente 1 cm incluindo alça ligada intestinalremendo ing Peyer foi criada. 3. Bactérias absorvidas pelas células M foram marcados por fluorescente reagente rotulagem de fluorescência ou por superexpressão da proteína fluorescente como a proteína verde fluorescente (GFP). 4. Células M no epitélio folicular associada cobrindo mancha de Peyer foram detectadas por todo o monte immunostainig com o anticorpo anti Gp2. 5. Fluorescentes transcitose bacteriana por células M foram observados por análise microscópica confocal. Corrigir o Peyer rato ensaio de alça intestinal poderia fornecer a resposta que tipo de bactérias patogênicas ou comensais transcytosed pelas células M, e pode nos levar a entender o mecanismo molecular de como estimular o sistema imunológico da mucosa através de células M.
Protocol
Discussion
O tempo de incubação do patch Peyer ligada com suspensão bacteriana é geralmente para 1 hora de observar a incorporação de bactérias nas células M. Em caso de 4 horas de incubação, as bactérias são muitas vezes detectados na zona de células T de placas de Peyer. Como a anestesia inalatória com isoflurano vaporizado poderia manter ratos estável, o tempo de incubação do patch Peyer ligada com suspensão bacteriana é extensível para observar as bactérias que se movem em T-cell zona no patch de Pey…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a todos os membros do BEI para o desenvolvimento desta técnica. Esta pesquisa foi apoiada em parte por Grant-in-Aid para a Investigação Científica em Áreas Prioritárias "Traffic Membrane" (HO), e "Matriz de Fenômenos Infecciosas" (KH), Jovens Cientistas (SF e KH), e da Investigação Científica (HO ), Investigação Científica e em áreas inovadoras "Logística intracelular" (HO), do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| LB Agar Ampicillin- 100 |
SIGMA | L5667 | |
| Cy3 mono-Reactive Dye Pack |
GE Healthcare | PA23001 | |
| Alexa Fluor 350 carboxylic acid, succinimidyl ester |
Invitrogen | A10168 | |
| Inhalation anesthesia apparatus |
Shinano Seisakusho | SN-487 | |
| Fixation and Permeabilization Solution |
BD | 554722 | |
| Anti mouse Glycoprotein 2 antibody |
MBL | D278-3 | 200-fold dilution (5μg/ml) |
| Goat Anti-Rat IgG, F(ab’)2 fragment specific |
Jackson ImmunoResearch |
112-505-006 | 200-fold dilution (20μg/ml) |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin |
Molecular Probes | A22284 | 50-fold dilution |
| Confocal laser scanning microscope |
Leica Microsystems | DMIRE2 | |
| DeltaVision Restoration deconvolution microscope |
Applied Precision | DeltaVision Core |
Riferimenti
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