La aplicación de un ratón ligado Ensayo placas de Peyer asa intestinal para evaluar la absorción por las células bacterianas M

Summary

Las células M en un folículo especializada asociada a epitelio que recubre las placas de Peyer juegan un papel importante para el inmunovigilancia la mucosa en el intestino de tejido linfoide asociado. Aquí se describe el método de evaluación para transcitosis bacteriana por las células M<em> En vivo</em>. Este método proporciona un método para comprender M-función de las células del sistema inmunológico.

Abstract

El interior de nuestro intestino es habitado por gran número de bacterias comensales. La superficie de la mucosa del tracto gastrointestinal está continuamente expuesta a ellos y, ocasionalmente, a los agentes patógenos. El tejido linfoide asociado al intestino (GALT) juegan un papel clave para la inducción de la respuesta inmune de la mucosa de estos microbios ^{1, 2.} Para iniciar la respuesta inmune de la mucosa, los antígenos de la mucosa debe ser transportado desde el lumen intestinal a través de la barrera epitelial en folículos linfoides organizados, tales como las placas de Peyer. Este transcitosis antígeno está mediada por células especializadas del epitelio M ^{3, 4.} Las células M son células atípicas del epitelio que fagocitan activamente macromoléculas y los microbios. A diferencia de las células dendríticas (DC) y los macrófagos, que los antígenos objetivo de los lisosomas para la degradación de las células M, principalmente transcytose los antígenos internalizados. Este transcitosis macromoleculares vigorosa a través de las células M ofrece a los antígenos subyacente folículos linfoides organizó unad se cree que es esencial para iniciar antígenos específicos de las respuestas inmunitarias de las mucosas. Sin embargo, los mecanismos moleculares de la promoción de esta captación de antígenos por las células M son en gran parte desconocido. Hemos informado anteriormente de que la glicoproteína 2 (GP2), específicamente expresado en la membrana plasmática apical de las células M entre los enterocitos, sirve como un receptor transcytotic para un subconjunto de comensales y enterobacterias patógenas, incluyendo Escherichia coli y Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium ), mediante el reconocimiento de FimH, un componente de tipo I pili en la membrana bacteriana externa ^5. A continuación, presentamos un método para la aplicación de un ensayo de Peyer del ratón bucle parche para evaluar la absorción intestinal de bacterias por las células M. Este método es una versión mejorada del ensayo con ratones asa intestinal se ha descrito anteriormente ^{6, 7.} Los puntos de mejora son los siguientes: 1. Isoflurano fue utilizado como un agente anestésico. 2. Aproximadamente 1 cm incluyendo ligado asa intestinalING parche de Peyer se creó. 3. Las bacterias tomadas por las células M se marcaron con fluorescencia mediante reactivo de marcaje fluorescente o sobreexpresión de la proteína por fluorescentes, como la proteína verde fluorescente (GFP). 4. Las células M del epitelio folicular asociada que cubre las placas de Peyer se detectaron por todo el montaje immunostainig con anticuerpos anti GP2. 5. Fluorescentes transcitosis bacteriana por las células M fueron observados por el análisis microscópico confocal. El ensayo de Peyer del ratón parche asa intestinal puede proporcionar la respuesta qué tipo de comensales o bacterias patógenas transcytosed por las células M, y puede llevarnos a comprender el mecanismo molecular de cómo estimular el sistema inmunológico de la mucosa a través de las células M.

Protocol

1. Preparación de las células bacterianas Glicerol racha surtido bacterias fluorescentes (GFP, como expresión de S. typhimurium) en una placa de agar LB que contenía 100 mg / ml de ampicilina. La cultura de una sola colonia de agar LB durante la noche en 2 ml de medio LB nuevo. Añadir 0,5 ml de cultivo bacteriano y 4,5 ml de medio LB e incubar nuevas hasta que la densidad óptica de 1,0 a 600 nm se alcanza. Cosecha de células bacterianas por centrifugación (3.000 …

Discussion

El tiempo de incubación de parches de Peyer ligado con la suspensión bacteriana suele ser de 1 hora para observar la incorporación de bacterias en las células M. En el caso de cuatro horas de incubación, las bacterias a menudo se detectan en la zona de las células T de las placas de Peyer. A medida que la anestesia con isoflurano vaporizado inhalantes podría mantener estables los ratones, el tiempo de incubación de las placas de Peyer ligado con la suspensión bacteriana se puede ampliar para observar las …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
LB Agar Ampicillin- 100	SIGMA	L5667
Cy3 mono-Reactive Dye Pack	GE Healthcare	PA23001
Alexa Fluor 350 carboxylic acid, succinimidyl ester	Invitrogen	A10168
Inhalation anesthesia apparatus	Shinano Seisakusho	SN-487
Fixation and Permeabilization Solution	BD	554722
Anti mouse Glycoprotein 2 antibody	MBL	D278-3	200-fold dilution (5μg/ml)
Goat Anti-Rat IgG, F(ab’)2 fragment specific	Jackson ImmunoResearch	112-505-006	200-fold dilution (20μg/ml)
Alexa Fluor 633 Phalloidin	Molecular Probes	A22284	50-fold dilution
Confocal laser scanning microscope	Leica Microsystems	DMIRE2
DeltaVision Restoration deconvolution microscope	Applied Precision	DeltaVision Core