木质纤维素材料的高通量检测糖化

Summary

描述一个简单，快速的方法确定了大量的植物生物量的样品糖化潜力。这种分析的自动化平台，涉及植物生物量在96孔板和随后的表现预处理，水解和释放糖的定量分析的准备。

Abstract

多糖，使植物木质纤维素生物质可以分解，产生的范围，随后可用于建立生物炼制的糖。这些原料将构成一个新的产业平台，这是可持续发展和碳中性，以取代目前对化石燃料的的依赖。在木质纤维素材料中观察到的解构顽抗是由植物细胞壁的内在属性。结晶纤维素嵌入xylans和arabinoxylans矩阵如多糖，整个结构是由木质素酚醛树脂聚合物，这也是难以消化¹包裹。为了提高我们需要发现为细胞壁的糖化主要瓶颈，也屏幕突变和繁殖种群，以评估糖化²变异的植物原料的消化率。这些任务需要高吞吐量的方法，在这里，我们提出了一个分析平台，可以在96孔板格式执行糖化分析。这个平台已经发展到允许筛选不同植物物种的大量人口的纤维素消化率。我们温柔的预处理，部分酶解和糖的决心反应体积缩小，使大批自动化系统迅速进行评估。

这种自动化平台毫克的生物量，在受控条件下进行球磨，以减少植物材料，在一个可重复的方式进行了标准化的粒径。一旦样品的地面，自动格式化机器人分配到相应的水井深96孔板（图1）指定的材料和记录的金额。通常情况下，我们免除进入4口井有4分析重复相同的材料。一旦板块与植物所需的布局材料填充，他们是手动移动到液体处理站（图2）。在此站的样品受到与任稀酸或碱性温和的预处理，在孵育温度高达90 ° C随后被删除的预处理解决方案，并退回给适宜的pH为水解的样品用缓冲液冲洗。样本，然后培养的时间变长酶的混合物在50 ° C。一个等分是从水解还原糖自动MBTH比色法确定。

Protocol

1。样品的制备我们正常的工作，无论从草本或木本植物的茎。草本材料的情况下，我们种植的植物成熟，种子开发后，我们收集干茎衰老是一旦完成。茎切成4毫米段，并放置在三个磨球2 mL样品瓶。在木质材料的情况下，样品地面粗木屑，当然木材文件，然后放置在球磨机进行进一步的处理。 样品被放置在一个机架内研磨/格式化站（图1）。这个站的顺序研磨，混合，和重量每一个样本。每个样品需要重复的数量是建立在一系列一定粒径的内在变化是确定的初步实验测试的地面材料。 2 mL样品瓶底部刺穿和材料免除小瓶选定的振动。振动臂粉准确配药允许平衡反馈控制。机器人分配4毫克/在一个标准的分析，并在大多数的情况下需要4重复。这使得20个植物样品/板进行分析。 2。预处理一旦样品被格式化，处理96孔板自动化液体处理系统（图2）。这里是一个温和的预处理植物材料加入350μL酸性或碱性溶液和适应块板加热。为了避免在分析过程中的蒸发，96孔板密封用硅胶马特。根据所研究的材料预处理的温度和时间可以进行修改。然而，最高温度100 ° C。替代程序是一个用于测试更严厉的预处理预处理脱线的材料和消除的过程pretreatmet。 3。水解材料预处理后，机器人会自动删除的预处理解决方案，并清洗，所有的水井，850μL25毫米醋酸缓冲液的5倍。进行冲洗是加入缓冲液的预处理解决方案，并随后删除后，让样品中的固体解决的总体积的50％。愿望的高度设置，以避免从井底吸固体液体质量的一半;有使用这种方法的固体的损失可以忽略不计。这些洗涤后在井的pH值是4.5和材料准备酶解。 添加一种酶的混合物中含有的纤维素和半纤维素酶的解决方案是由机器人。每孔850μL酶的混合物配发板是在50 ° C摇床提出。执行标准水解为8小时，但此时可适应实验的目的。草使用的标准酶量是7 FPU / g的材料。 4。还原糖的检测减少水解后释放的糖的测定是使用修改后的3 -甲基-2 -苯并噻唑啉hydrozone（MTBH）方法3。 MBTH被选定为最合适的方法，因为它是最简单的自动化和最不容易受到干扰的化合物，如蛋白质的。我们修改了机器人平台上使用这一高度敏感的方法，使其能够准确量化生物质水解液中的浓度的糖，与终体积为250μL，这是一个标准的光学96孔板。自动执行下面的所有步骤和三个独立的还原糖测定每个糖化反应。 30μL蛋白水解物是从深孔板和25毫米的钠加防护罩的PCR 96孔板中的醋酸缓冲液45μL混合。 分别加入25μL1N氢氧化钠和50μL含有0.43毫克/毫升MBTH和0.14毫克/毫升的数码地面电视解决方案。 混合后，PCR板加热60 ° C为20分钟在热循环或类似设备提供完全相同数量的热量，所有96个井。 被转移到一个光板所产生的反应。 加入100μL氧化试剂（0.2％FeNH4（SO4）2，氨基磺酸0.2％和0.1％的盐酸）。拌匀，离开发展，至少1小时。 每个板块还应该包含50 nmol，加入100 nmol，150 nmol葡萄糖的标准反应。在620 nm处读取光板。 5。代表性的成果： 分析不同类型的例子是在图3和4。结果全部获得通过使用自动化的平台。图3重呈现减少8小时，从地面杨树孵化释放糖与纤维素酶的数量不断增加的增加。图4给出了杨树样品的酸和碱预处理的影响。的NaOH预处理是更有效的促进水解过程中释放的糖的稀释硫酸预处理。水解后测糖量减少时使用大于1M的氢氧化钠浓度进行预处理。 图1。磨和96生物质能以及格式的机器人站 图2液处理站的高通量糖化分析。 对不同的酶负荷释放减少杨树样本的糖等值图 3。 图4。A.对杨树样本的糖化，不同的预处理。pretreament与不同比例的硫酸在90℃30分钟后发表的糖。B.氢氧化钠预处理后糖酸预处理比在相同的温度和时间公布。

Discussion

Variations of the standard saccharification protocol can be used in the same platform for determining the activity of cellulolytic enzymes (i.e. by variation of the enzyme concentrations used in a plate as well as using paper as substrate); comparison of the efficiency of several enzyme mixtures on a specific material; time course for saccharification; etc.

A standard saccharification protocol to compare the saccharification potential in different plant materials involves an eight hour hydrolysis (Figures 3 and 4). Most of the plant materials analysed requires four replicates. Under these conditions, the platform can process 80 samples/day. This analysis is being used to screen large populations of barley, maize, and brachypodium in order to establish variability in saccharification potential and the genes involved in its determination⁴.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Grinding & weighing robot	Labman Automation
2 ml micro tube with caps	Sarstedt Ltd	72.694
5 mm stainless steel beads	Qiagen Ltd	69989
1.2ml Abgene square well storage plates	Fisher Scientific Ltd	TUL-050-050C
Whatman cap mat for 96 square well plates	Fisher Scientific Ltd	7704-0104
Liquid hanling robot	Tecan Group Ltd.	Freedom Evo 200
Sulphuric acid	Fisher Scientific Ltd	S/9231/PB17
Sodium hydroxide	Fisher Scientific Ltd	BPE359-500
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S8750-500G
Acetic acid	Fisher Scientific Ltd	A/0420/PB17
Novozyme 188	Novozyme	DCN00214
Celluclast 1.5L	Novozyme	CCN03122
96 well PCR full skirt plates	Sarstedt Ltd	72.1980.202
D-Glucose	Fisher Scientific Ltd	G/0450/53
3-Methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	129739-25G
DL-dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D9163-1G
Corning microplate 96 well flat bottom	Fisher Scientific Ltd	TKT-521-050H
Ammonium iron (III) sulfate dodecahydrate	Sigma-Aldrich	F1668-250G
Sulfamic acid	Sigma-Aldrich	242772-500G
Hydrochloric acid	Fisher Scientific Ltd	12462-0026