Dit protocol beschrijft hoe het kwantificeren van de Mg (II)-afhankelijke vorming van RNA tertiaire structuur door twee methoden van hydroxyl-radicaal voetafdruk.
RNA-moleculen spelen een essentiële rol in de biologie. Naast het overbrengen van genetische informatie, kan RNA vouwen in unieke tertiaire structuren vervullen van een specifieke biologische rol als regelgever, bindmiddel of katalysator. Informatie over de tertiaire formatie contact is essentieel voor de functie van RNA-moleculen te begrijpen. Hydroxyl-radicalen (• OH) zijn uniek probes van de structuur van nucleïnezuren vanwege hun hoge reactiviteit en de geringe afmetingen. 1 Bij gebruik als een footprinting probe, hydroxyl-radicalen kaart het oplosmiddel bereikbare buitenzijde van het fosfodiester ruggengraat van DNA en RNA een 2 met zo fijn als single nucleotide resolutie. Hydroxyl radicaal footprinting kan worden gebruikt om de nucleotiden in een intermoleculaire contact oppervlak, bijvoorbeeld in DNA-eiwit 1 en RNA-eiwit complexen te identificeren. Evenwicht 3 en kinetische vier overgangen kan worden bepaald door het uitvoeren van hydroxyl radicaal footprinting als een functie van een solutiop variabele of tijd, respectievelijk. Een belangrijk kenmerk van de voetafdruk is dat beperkte blootstelling aan de sonde (bijvoorbeeld 'single-hit kinetiek') resulteert in de uniforme bemonstering van elke nucleotide van het polymeer. 5
In deze video artikel, gebruiken we de P4-P6 domein van de Tetrahymena ribozym om RNA-monstervoorbereiding en het bepalen van een Mg (II)-gemedieerde vouwen isothermen illustreren. We beschrijven het gebruik van de bekende hydroxylradicaal footprinting protocol dat H 2 O 2 (we noemen dit de 'peroxidative "protocol) en een waardevol, maar niet algemeen bekend, alternatief, dat van nature opgeloste O 2 gebruikt (we noemen dit vereist het' oxidatieve 'protocol). Een overzicht van de datareductie, transformatie-en analyseprocedures wordt gepresenteerd.
Hydroxyl radicaal voetafdruk is een waardevol instrument om het oplosmiddel toegankelijke oppervlakte van nucleïnezuren te beoordelen. Kwalitatieve en kwantitatieve vorming van tertiaire structuur 14 kan worden gevolgd als een functie van parameters zoals ion type en de concentratie, pH, temperatuur, bindende eiwitten of vouwen co-factoren. De uitstekende combinatie van een straight forward en goedkoop protocol en de daaruit voortvloeiende oplosmiddel toegankelijkheid en vouwen informatie op een single-nucle…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de National Institute of Health RO1-GM085130 en National Science Foundation MCB0929394. Wij danken dr. Marion Schmidt voor haar gastvrijheid en voor het toestaan ons te filmen in haar laboratorium.
Name | Company | Cat# |
---|---|---|
Sodium Cacodylate (Caution! Toxic) | Sigma | C4945-25g |
EDTA (0.5 M) | Ambion | AM9260G |
DEPC treated water | Ambion | AM9915G |
Sodium Acetate (3 M) | Ambion | AM9740 |
MgCl2 (1 M) | Ambion | AM9530G |
Urea | Ambion | AM9902 |
Sodium Citrate | Sigma | W302600 |
tRNA | Sigma | R-7876 |
Sodium-L-ascorbate | Sigma | A7631-25g |
Fe(NH4)2(SO4)2 . 6 H2O | Sigma | F1543-500g |
RNase T1 | Fermentas | EN0541 |
Hydrogen Peroxide (30%) | Sigma | 349887 |