ビデオレートでスキャニング共焦点顕微鏡とMicroendoscopy

Summary

カスタム、リアルタイムの走査型共焦点イメージングシステムの完全な構造が記載されている。容易にビデオレートの顕微鏡とmicroendoscopyに使用することができるこのシステムは、コストのほんの一部で、標準的な商用共焦点システムを使用してアクセスできませんイメージングジオメトリとアプリケーションの配列が可能になります。

Abstract

共焦点顕微鏡は、迅速、高感度、および複雑なシステムの高解像度の光学セクショニングを可能にする、生物学および生物医学科学の非常に貴重なツールとなっています。共焦点顕微鏡は、日常的に生細胞内^2-4を特定の細胞標的^1、モニターダイナミクスを研究し、全体の生物^5,6の三次元進化を視覚化するために、例えば、使用されています。このような共焦点microendoscopesなどの共焦点イメージングシステムの拡張機能は、 生体内 ⁷ の高分解能イメージングが可能で、現在臨床の設定^8,9の疾患のイメージングと診断に適用されている。

共焦点顕微鏡は、単純な幾何光学を使用して、いわゆる"光学セクション"を作成することによって三次元分解能を提供します。標準的な広視野顕微鏡では、試料から発生する蛍光は、対物レンズによって収集され、検出器に直接中継。受け入れる一方、イメージング薄いサンプルのことが、厚い試料は客観的な焦点面の上下に発生する蛍光がぼやける。対照的に、共焦点顕微鏡は、試料の高分解能3次元表現を構築するためにアウトフォーカスの光を拒絶する、サンプルの仮想、光学セクショニングが可能になります。

共焦点顕微鏡は、検出のビーム経路に焦点アパーチャを使用してこの偉業を達成。客観的で、サンプルから収集された蛍光は、スキャニングミラーを介して、プライマリダイクロイックミラー、慎重に長く、ストークスシフト蛍光放出を渡しながら、このようなレーザの励起光として短い波長を反映するように選択したミラーを介して中継される。この長波長の蛍光信号は、対物レンズの焦点面と正確に共役平面に配置されているピンホールの両側にレンズのペアに渡されます。オブジェクトの焦点ボリュームから収集された光子は、コリメートされています対物レンズにより、ピンホールを介して共焦点レンズにより集光されています。焦点面の上または下に生成された蛍光は、したがって、適切にコリメートされず、顕微鏡の焦点からの光だけが見えるような光学部を作成し、共焦点ピンホール¹を通過しません。 （ 図1）。したがって、ピンホールが効果的に唯一の限られた空間的な位置に検出された放射を閉じ込め、焦点面内の仮想アパーチャとして機能します。

近代的な商業共焦点顕微鏡では比較的簡単とアクセス可能な以前は複雑な画像処理手順を作成する、ユーザーは完全に自動化された操作を提供します。これらのシステムの柔軟性とパワーにもかかわらず、商業的な共焦点顕微鏡は、このようなin vivoイメージングの用途で多くのようにすべての共焦点イメージングタスクに適していません。彼らのニーズを満たすためにカスタマイズされたイメージングシステムを作成する機能がなければ、重要な実験がリアクタンスから残ることができる多くの科学者へのH。

この記事では、我々は基本的なコンポーネントからカスタム、ビデオレート共焦点イメージングシステムの完全な構築のためのステップバイステップの方法を提供します。正立顕微鏡は、標準速度共振ガルバノミラーは、遅軸をスキャンしながら、高速走査軸を提供するために、共振ガルバノミラーを用いて構築されます。対物レンズのフォーカスの正確なスキャンビームを作成するには、これらのミラーは、4つのリレーレンズを使用して、いわゆるテレセントリック平面に配置されます。共焦点検出は標準的な、既製の光電子増倍管（PMT）を使用して実行され、画像がキャプチャされ、Matroxの画像取込装置のカードと付属のソフトウェアを使用して表示されます。

Protocol

レーザー波長、ダイクロイックミラー、光学フィルターの選択は、実験で使用されている特定の染料に基づいて決定されるべきである。例えば、のAlexa Fluor 488で染色されたサンプルの共焦点イメージングは​​、最高の488 nmのレーザー、500nmのロングパスダイクロイックミラー、515 nmで中心と30nmの帯域幅のバンドパスミラーを使用して行われます。対照的に、赤い色素のAlexa Fluor 647の共焦点イメージングは​​、成分の異なるセットが必要となります。このプロトコルの顕微鏡は、400nmで強く吸収し、450nmのを超えて放射するあらゆる染料を可視化するために建てられました。そこで、406 nm励起レーザーと425nmのレーザービームを反射するロングパスダイクロイックを選んだ。励起蛍光を選択的に適切な発光フィルターを選択することで想像することができます。不適切またはその場しのぎのハードウェアは、同様に位置合わせを保持せず、安全上の問題にすることはできますが、示されたプロトコルを通じて適切な光学マウント用部品を使用することが重要です。 <Pクラス="jove_title"> 1。共振ガルバノミラーとリレー光学系の設定走査型共焦点システムの任意の種類を構築する上で重要な概念は、テレセントリックである。テレセントリック光学系では、レンズ系の倍率は単純に焦点距離が1の比で定義されるように彼らの焦点距離の和で互いに離間されています。これにより、倍率、およびそのためのシステムプロパティは、簡単にレンズの選択によって定義されている光中継系の構築を可能にします。もう1つの重要な概念はまた、"開口面"と呼ばれる、いわゆる"静止"光学面を含む。開口面は、光ビームが横方向の動きのあらゆる種類を起こさない光路に沿った位置です。最初と第2の走査ミラー、および対物レンズの背面口径：この顕微鏡の設計では、3つの重要な開口面があります。最適なビームSCAを達成するために目標の焦点面でnning、対物レンズの背面開口部に入る光線は角度のみで掃引し、静止している必要があります。この静止、角度掃引面を作成するために、我々は客観的なバック開口部に共役第一および第二スキャンミラー、テレセントリック平面を配置する必要があります。ミラーと対物レンズ間に配置されたレンズは、これらの固定面（ 図2）の間の角度-スキャンされたビームを中継する役割を果たす。スキャニングミラーは撮像面（XおよびY）の与えられた方向を走査する責任を2つスキャンgalvos、上に搭載されています。ビデオレートイメージングのために必要なラインのスキャンレートを取得するには、高周波の共振ガルバノは、x軸を（また"速い"軸とも呼ばれる）をスキャンする必要があります。これらgalvosは、正弦波のスキャンパターンを作成するために敏感な、閉ループフィードバック回路を利用すると非常に高い周波数で動作することができます。我々は、このビルドの8 kHzの亜鉛めっき鉄板を選択。 設定光学マウントの光ファイバコリメータは、と乱暴に、水平垂直両方向に直線で移動するように調整ネジを使ってビームを導くことができます。今、アイリスを取るとビームが虹彩の中心を通るきれいに通るようにアイリスの縦の高さを調整し、光ファイバコリメータの前に配置します。次に、ビームの経路に沿って離れてコリメータから虹彩を移動し、ビームはまだ虹彩の中心を通過するかどうかを観察。されていない場合は、2本の調整ネジを使って虹彩上のビームの位置を調整します。 ミラーのほぼ中央に位置するレーザービームとビームのパスにマウントされているダイクロイックミラーを置きます。テーブルにミラーをクランプする前に、約90度のビームを反射し、ほぼ反射されたレーザービームの垂直方向の高さが変化しないように反射を調整するためにミラーホルダーを回転させる。 車を取って、レーザーの光路内にマウントされている共振ガルバノミラーを配置レーザービームは、ミラーの表面の正確な水平方向の中央に配置されていることを保証する電子。このプロトコルでは、共振ガルバノミラーは、ミラーのマウントに直接expoxiedした。 90度の角度でレーザービームを反射するミラーマウントを回転させます。ほぼ同一のレーザービームの垂直高さを維持するためにミラーからの反射を調整する。 与えられた方向における光の任意の光線を指示するためには、一つの定義で光線に旅行するときに使用される空間内の2つのポイントを定義する必要があります。これは、典型的には、所望の水平方向および垂直方向のパスに沿って2つの虹彩を配置し、それぞれの虹彩の中心を通過するレーザービームを操作することによって実現されます。 4自由度は、ビームを調整するために必要され、各絞りの自由の二つの水平および垂直度を。自由のこれらの度を達成するための最も一般的で簡単な方法は2つの舵を取るのミラー、または"歩く、"レーザービームを使用することです。 two虹彩を取る、そしてそれらの垂直高さなどを設定する手順1.1で、レーザービームを使用すると、参照として共振ガルバノミラーを反射。今、目のガイドなどの光学ブレッドボード上のネジ穴を使用して、直線で2つ下の虹彩をクランプする。 ダイクロイックミラー二虹彩の中心を通るレーザービームを操縦するために共振ガルバノミラーを調整します。第一アイリスでビームは、2番目の虹彩の中央線へのパス第二のミラー（共振ガルバノミラー）を使用する中央へのパス内の最初のミラー（ダイクロイックミラー）を使用してください。ビームが両方の虹彩によって整列されるまで繰り返し共振ガルバノミラーから反射されたレーザービームはまだおおよそのミラーの中心部から反射されていることを通して確実に、これら2つのミラーを調整する。ビームがずれている場合は、ファイバコリメータのマウントを調整し、上記の反復手順を繰り返します。 両方の虹彩を中心にビームを、我々は今のイメージ私たちの最初の静止、テレセントリック計画をする2つのリレーレンズを配置します第二次固定、テレセントリック平面上への電子（ すなわち 、共振ガルバノミラー）（ すなわち 、標準速度ガルバノミラー）。この特定の顕微鏡の場合、最初のリレーで、選択したレンズは同じ焦点距離、"f"を持って、私たちのテレセントリック系の2つのミラー間の距離は単に4Fですので。レンズは正確に光路を中心にしていることを保証するために、レンズの位置合わせのトリックを使用してください。ビームのパスの最初のレンズを配置し、レンズに続くビームのパス内の次の虹彩にレーザー光のスポットを見てください。次に、垂直にビームの垂直方向の中心は、虹彩の中央に位置していることをレンズの高さを調整します。最後に、虹彩の中央ビームに水平方向のビーム位置を調整します。第二のレンズは、この同じ手順を行ってください。 2。第2の走査ミラーを設定し、顕微鏡を回転第二テレセントリック面の正確な位置を見つけるために、ために共振ガルバノをフックその走査ユニットと、電源を入れます。二つのレンズを通して走査ビームを追跡するために白い名刺を使用してください。あなたは、レーザービームが完全に静止して表示される共振ガルバノ、から4Fのおおよその距離にテレセントリック平面を見つける。ブレッドボード上のこの位置をマークします。 この正確なテレセントリック平面の位置で標準走査ガルバノミラーを置き、ミラーの高さとテレセントリック平面におけるビームは、走査ミラーの正確な中心に当たるような位置を調整します。それはパワーアップミラーの制御ハードウェアをとミラーは、このプロセス中にその中立位置に落ち着くように、走査ミラーの入力で0ボルトの電圧を置く非常に重要です。慎重に垂直にビームを向けるためにミラーの角度を調整し、ゆっくりと位置にミラーを締めます。 我々は正立顕微鏡を構築しているとして、我々は今90度の取付金具を使用して90度の角度で2番目のブレッドボードをアタッチします。オフにすることを確認してくださいレーザーと走査型電子機器は、光ファイバを切断し、このプロセス中にスキャンミラーを外してください。アライメントの残りの部分を簡単にするために、いったん括弧は慎重に新しいブレッドボードは今平らになるように全体の顕微鏡を回転させ、所定の位置にボルトで固定されています。作業面にブレッドボードを固定するクランプを使用してください。今すぐ以前は垂直セットアップの残りの部分は、簡単にフラットブレッドボード上で行うことができます。 3。スキャン、チューブ、および対物レンズの設定次に我々は正式に"スキャンレンズ"と"チューブレンズ"と呼ばれるリレーレンズ、2番目のセットを設定します。客観的な焦点で正しい倍率を達成し、最終的な画像の解像度を最適化するようにレンズの適切な組み合わせを選択することが重要です。最初に、任意の対物レンズの最大開口数（NA）を達成するために、目標の背面を打つレーザービームは入力する必要があります背面開口部を完全に、だけにして対物レンズには厳しいフォーカスを作成できるようになります。対物レンズは、バック開口サイズの範囲を持っている。若干、選択された目的の背面開口部を詰め込み過ぎないようにレンズの倍率を選択しました。第二に、右の倍率を達成するために、対物レンズは、それが設計されたチューブのレンズ焦点距離と一致させる必要があります。残念なことに、別の顕微鏡対物メーカーが異なるチューブレンズ焦点距離を使用することにしましたので、用いられる特定の対物レンズの正しいチューブレンズと顕微鏡を構築することが重要です。さらに、そのようなツァイスなどの特定のメーカーは、不適切な客観-チューブレンズのペアを使用すると、実際にはそうでない場合は存在しない新たな収差を導入するような彼らの一致した目標の特定の色収差を補正するために彼らのチューブレンズを設計する。すべての色補正が目に行われるように我々は一般的に、オリンパスの目標を好むeは目標自体が、簡単にペアリングを客観的/チューブレンズとなっています。顕微鏡はまだ動作しますが、客観的とチューブレンズが一致しない場合は、実際の顕微鏡の倍率は、おそらく、対物レンズに記載されている倍率とは一致しません。この特定の顕微鏡の構築のために、最適なバックの開口部のサイズは、スキャンレンズとチューブレンズとの間の1:4の倍率を必要とする、4ミリメートルと決定した。このカスタム顕微鏡の構築のために、我々は75 mmと300 mmのチューブレンズの長さのスキャンレンズの長さを使用します。 秒のスキャンミラーと対物フォーカス間の総距離が大きいことから、顕微鏡のこのセグメントは、構築する最初のレイアウトは、対物レンズに光を導くために必要なミラーなります。近くにブレッドボードのエッジへの最初の大規模な、2"（50 mm）の直径のミラーを配置し、レーザービームを約90度を反映するようにミラーマウントを回転させる。ほぼ同じ縦のBEAを維持するためにミラーからの反射を調整するmの高さ。 90度の角度で下方にビームを向ける方向で、ブレッドボードの反対側の端にある他の2"のミラーを置きます。ビームの垂直方向の高さは変更しないように調整ネジを使用してください。ステップ1.4のように2つの虹彩を設定し、のような虹彩のビーム中心に、ステップ1.5に向け2つのミラーを調整する。 第一虹彩上にレーザスポットをまだ場所に菖蒲と、ビーム経路にスキャンレンズを配置し、中央にその水平位置と垂直位置を調整します。 75ミリメートル+レンズ（つのミラー間）から300 mmの距離で、慎重に大型2"チューブレンズを配置し、中央にその水平位置と垂直位置を調整する第一の虹彩上にビーム。将来的にアライメントを維持する目的のために、その場でこれらの虹彩を残すために有用であり、このアプリケーションのために、適切なサイズの穴付きビジネスカードはスタンドに接着される可能性があり、ビームの経路に挿入。 すべてのミラーとレンズと今の場所で、共振ガルバノミラーと標準走査ミラーをスキャンを開始。このビルドでは、標準的な走査ミラーは、最終的には、図3で説明したように、カスタムビルドの制御回路を介して共振ミラーの走査速度に同期されますが、これは優れた垂直および水平同期を提供します。しかし、アライメントの目的と多くのイメージングアプリケーション用に、ミラーは簡単にファンクションジェネレータから鋸歯状パターンを使用してスキャンすることができます。名刺を使用して、位置にチューブレンズの後に300mmをレーザービームを探します。ビームは、垂直と水平の両方向での顕微鏡の他の場所でスキャンされていますが、ビームはこの場所の近くに完全に固定してください。これは、対物レンズの背面開口部が置かれる場所です。水平と垂直の固定面が光路に沿って同一平面上で一致しない場合、慎重にそれを確保するために光路に沿ってアンクランプとチューブレンズを翻訳両方のプレーンは、可能な限り密接に重なる。再中央チューブレンズの垂直方向と水平方向の位置との位置にしっかりと固定します。 可能な限り静止平面に近い位置に戻って絞り、対物レンズの位置を確認しながら、ビーム経路に対物レンズを配置。真の客観的なバック開口部は、実際には常に様々なメーカーの設計の選択による客観の物理的な背面の開口部に配置されていない可能性があります。それは、真のバックの開口部の位置を決定するために常に最善のため、メーカーとのチェックです。 z軸の動きを可能にする翻訳のマウントは、対物レンズのマウントに実行せずに、その全範囲にわたって移動できることを確認し、サンプルステージを設定します。 4。セットアップと共焦点ピンホールと検出器を整列させるすべての電源装置と光ファイバを切断し、再び分解能を保持しているブレッドボード上に乗っているような顕微鏡のアセンブリーを回転させNAntの走査ミラー。両方galvosとそれらの制御ケーブルを所定の位置にしっかりブレッドボードを固定して、コリメータにファイバを再接続、および再接続。標準スキャンガルボを駆動する制御電圧で前と同じように、場所0ボルトを。 試料ステージでは、ビジネスカードまたは2つのカバーガラスの間に挟ま客観焦点の明るい色素、少量を置きます。染料の選択は、選択されたレーザーとダイクロイックに依存しますが、この場合に我々は、共焦点検出システムを合わせるために白の名刺からの蛍光発光を使用します。彼らは明るく、光退色しないように量子ドットはまた、アラインメントのために有効に使えます。他の選択肢は、鮮やかな蛍光を発するどちらの色/洗濯光沢にさらされた蛍光ビーズおよび/または生地サンプルを、含まれています。レーザ光源をオンにし、翻訳の段階を使用して、顕微鏡の焦点に試料をもたらす。一度フォーカス、試料から発生する蛍光は、tの後ろに見えるはずですて、次の手順で説明する彼ダイクロイックミラー、。できるだけ明るい蛍光を作るためにレーザーパワーを最大化。 名刺を使用して、ダイクロイックミラーへのスキャニングシステムを介して対物レンズとバックを介して試料からの蛍光発光をトレース。レーザ光を反射しながらダイクロイックミラーは、蛍光発光を送信します。ダイクロイックミラーの反対側にあるこの蛍光シグナルを見つける。今、ダイクロイックミラーの後ろにミラーを配置し、90度の角度で放出を反映するためにそれを使用。手順1.1で行ったように、アイリスを取る、そしてできるだけまっすぐにし、ブレッドボードに平行に蛍光ビームを誘導するミラーと一緒に使用してください。このステップは最高の薄明かりの中で行うことができる。 図2で説明した共焦点ピンホールユニットを設定します。我々はThorLabsから空間フィルタケージマウントアセンブリは、このタスクに理想的であることを発見した。適切なpinholを選択することが重要ですeは、サイズ共焦点システムがあまりにも多くの信号を犠牲にすることなく最適な解像度に達することを保証する。このカスタム顕微鏡の場合は、100μmのピンホールのサイズが選択されていました。中央に蛍光発光ビームの最初の集光レンズのマウントを注意しながら、蛍光光路に沿って空間フィルタユニットを置きます。明確な焦点がピンホールの表面上で観測できるようになるまでユニット（顕微鏡対物を使用することもできます）で、短い焦点距離のレンズをマウントした後、Z -変換マウントをスライドさせます。ユニット全体が蛍光ビームによって設定された正確な直線に沿って配向していることを確認してください。ブレッドボードにユニットを固定します。 ほとんどの試料からの発光も暗い部屋での周囲光のレベルに比べて弱いです。それは不可解な適切なシールディング/光が迷光と汚染から保護するための排出経路に沿って使用されることゆえ非常に重要です。さらに、高い周囲光のレベルは、特に過負荷および損傷多くの光電子増倍管を、Cがないとのそれらなりますurrent保護。 、ここに示したもののよう適切にシールドシステム、無迷光の混入はほとんどの部屋の光で動作が可能であり、読者は、それゆえに強く放射ビームのパスを囲むためにレンズのチューブを使用することを促される。 今、翻訳段階での調整ノブを使用して、体系的にピンホールを介して蛍光シグナルが最大となる点を見つけるために共焦点ピンホールを移動する。この位置は、最も簡単にピンホールマウントの表面上に2次元の検索を実行する2つの軸の調整を反復によって識別されます。信号最大化位置が検出されると、ピンホールの後にケージのマウントにコリメートレンズを配置。名刺を使用して共焦点ユニットを通過する蛍光発光を見つけ、そして放出される蛍光信号は、可能な限り平行になるまでの記事に沿ってコリメートレンズをスライドさせます。ビームはコリメートされると、レンズの浴槽内のビーム経路に適切なフィルタを配置してくださいE. 光電子増倍管（PMT）アセンブリを設定します。蛍光発光のビーム経路50 mmの焦点距離のレンズを配置し、名刺を使用して、その焦点を見つける。ブレッドボード上のこの位置をマークします。今、完全にレーザーをオフにする – これは重要である、などの浮遊または減衰レーザ光は永久にほとんどの光電子増倍管を損傷する可能性があります。その活性領域はできるだけマークフォーカルポイントの近くに位置するようにPMTを配置します。調節可能なレンズチューブを使用して集光レンズにPMTアセンブリを接続し、慎重にピンホールを、以下のすべての露出したビーム経路の周りに暗いテープを包む。 レーザーをオンにするが、蛍光発光がほとんど見えない状態になるような極端に低いの電力に保つようにしてください。制御電圧が増加するにつれ、注意深くオシロスコープ上でその電圧を読み出し、PMTをオンにします。 PMTは、電子乗じの段階は、一連の信号を生成し、光電流は、入射光のレベルの高すぎる場合は、チューブにすることができます電流制限回路と不可逆的に損傷した。 光電子増倍管は、したがって、非常に、特に前に、そのような検出器を使用したことがないユーザーのために、推奨されています。 スパイク状の読み出しおよび/またはDCオフセットがオシロスコープの画面上で確認できるまで、PMT制御電圧を増加させる、ほとんどの光電子増倍管のため、この信号はグランドに対して負になります。この信号は実際に信号の損失を観察するためにレーザーの電源をオフにすることにより蛍光を発生することを確認してください。 最後に、繰り返し第一集束レンズのz位置を操作し、YZの移動ステージを調整することにより、オシロスコープの最大信号のピンホールを合わせます。 ビデオレートの顕微鏡のハードウェアは完了です！ 図3に図示したように、今鏡、カスタムコントロールボード、およびコンピュータを接続する。上記のように、それは最初に顕微鏡の最適な解像度を検出し、ピクセルを計算するために知られているサイズの標準を可視化するイメージングシステムを使用することを推奨します。間分解能イメージングシステムのための定数。このようなよく知られている文字のサイズ、蛍光又は反射空軍の目標、および蛍光マイクロスフェアと白の名刺として使用することができる多くのサイズの規格があります。 5。走査型共焦点microendoscopyできるようにシステムを準備するこの中で我々はファイバコアの何千人もの束で構成され首尾一貫したイメージファイバを、使用する構築、そのような配置は、画像が光ファイバを介して伝送することができますし、簡単に再構成されたおよび/ ​​またはもう一方の端（ 図4）で拡大した。この内視鏡の建設に使用される一貫性のある繊維束は、それはいわゆる"非接触モード"microendoscope作り、両端が研磨される。 microendoscopeの先端が物体と密着して置かれたときに焦点画像は、そのためだけ形成されます。この疑似共焦点配置では、顕微鏡の走査型アクションは、1つ、Fでレーザーを当て一度にiberコア、共焦点ピンホールが周囲の線維からのアウトフォーカスの光が検出器に通過を許可されていないことを保証しながら。別の画像アプリケーションの場合は、レンズのセットが前方に向き、長距離蛍光イメージングを可能にするために遠位端に追加することができます。 Microopticレンズだけでなく、勾配屈折率（GRIN）レンズは簡単にこの使用のために適応させることができる、と光学的品質の接着剤を使用して遠位ファイバチップに貼付することができます。 microendoscopyのためのイメージングシステムをセットアップするには、慎重に試料ステージを削除し、繊維の保持ステージ（ 図5）に交換してください。色素の弱い溶液中で繊維束のディップ一端その蛍光発光はファイバーコアのすべてに均等に生成されるように。スキャニングシステムの電源をオンにし、フォーカスの繊維束（近位端、または顕微鏡の光学系に近い側）の一方の端を持って来るためにファイバホルダを調整します。最初に、翻訳調節SCRを使用してスキャンされたフィールドの中心にEWSが繊維。スキャン中に今、近位繊維の先端から蛍光発光画像を見てください。完全なmicroendoscope面が目標の焦点面にあるとき、すべてのファイバコア間の蛍光発光は、可能な限り均一になります。すべてのファイバーコアが均等に明るくするために繊維の顔を調整する角度調整ノブを使用してください。この調整中に、それはおそらくスキャンされたフィールドで繊維の再中心に翻訳の位置を再調整する必要がある。全体の繊維の先端にフォーカスが正しくなるまで、これらの調整を反復処理します。 microendoscopeを使用する前に、静かに少しHPLCグレードのメタノールで湿らせたレンズクリーニングペーパーを使用して遠位端をきれいに。前と同様に、microendoscopeイメージングシステムの分解能を測定し、計算するために既知のサイズの標準を使用してください。 6。代表的な結果： 図6は、完成したUPRの例を示しています。microendoscopy用に設定さIGHT走査型共焦点顕微鏡。レーザーと放射ビームが目にガイドとして描かれている。繊維のマウントはmicroendoscopy操作中に場所のイメージファイバを保持しています。この繊維のマウントが容易に正立顕微鏡をプラットフォームとして使用するためのXYまたはXYZ並進ステージに置き換えることができます。 ThorLabs部品PT3（XYZへの変換）または2つの重なったPT1の段階は（XY翻訳）ThorLabsの一部AP90などの直角ブラケットと一緒に、このアプリケーションに適しています。 ビデオレートの画像取込装置のカードが入ってくる信号から画像を生成するために使用されます。図7は、ビデオレートの顕微鏡スキャニングシステムを使用して白い名刺に印刷されている小文字の"m"を撮影した代表的なテストのイメージを示しています。漂白ホワイトペーパーでは、暗い文字の"m"の後ろに明るい背景に、その結​​果、紫外線や青色光によって励起される蛍光物質が含まれています。 515 nmの中心発光フィルターは、この蛍光発光を収集するために選ばれました。メートル画像のinorの歪みは、特に画像のフレームの側縁の近くに、観察することができます。この歪みは、8kHz gavloミラーの正弦波走査パターンの結果、および以下で詳細に議論される。 図1共焦点顕微鏡の動作原理を示す図。客観的な焦点から発信された光線は、システムを介して中継され、共焦点ピンホール（赤）を介して集中している。上記のいずれか（青）または下（緑）の目的の焦点はコリメート目的から出ていないため、元の線が効率的に共焦点ピンホールを介して伝送されていません。 図2。ビーム走査システムを介してすべての光路を示す図。スキャニングミラーはSTAとテレセントリック面に座りtionary、客観的なバックの開口面。静止した平面の間にレンズのペアは、リレーにスキャンされたビームを行動する。最初の二つのリレーレンズは1:1の望遠鏡を形成し、等しい焦点距離を持っている。スキャンレンズとチューブレンズとして正式に知られているレンズの番目のペアは、、焦点距離に等しくなるように必要がある、と多くの場合、バック開口部がオーバーフィルドラウンチされ客観性を確保するためにビームの拡大望遠鏡として機能していない。サンプルから発せられた光は、スキャニングシステムを介して戻って移動し、ダイクロイックミラーを介して渡されます。短焦点レンズは、レンズにより平行化された共焦点ピンホールを介して放出光を当てています。最後のレンズは、光電子増倍管上に共焦点フィルタリングされた放射を当てています。 この画像のフルサイズバージョンを表示するにはここをクリック。 <img src="/files/ftp_upload/3252/3252fig3b.jpg" alt ="図3b"/> 図3（）走査型電子機器のセットアップの概要図。顕微鏡の全体的な基準信号とタイムベースがスキャンされたそれぞれの行の末尾のTTLパルスを生成する高速軸共振ガルバノミラー、（ すなわち 、亜鉛めっき鉄板はスキャンサイクルを完了したとき）の"同期"TTL出力です。これは、フレームグラバカードにH同期信号を提供します。亜鉛めっき鉄板の同期出力は、段階的に遅いスキャン軸を駆動する鋸歯状波形を生成するために、各水平同期パルスに応答してその出力電圧を増加させるV -同期制御ボードに接続されている。一度、すべての行がスキャンされている、V – syncのボードをリセットしノコギリ波とは、画像取込装置のV同期信号として機能するTTLパルスを生成します。フレームグラバカードへの最終的な入力は、光電子増倍管（多くの光電子増倍管は負の出力電圧を生成することに注意してからアナログ信号であり、実際の回路を設計してくださいD）に応じてハードウェアを選択します。ビデオレートの画像が生成され、Matroxの画像取込装置のソフトウェアに表示されます。 （b）実施例の制御回路。この設計では、それぞれH -同期パルスの電圧は、"追加"さ/のこぎり波の傾​​斜路を生成するために、オペアンプの積分器で統合、パルスが付随してTTLのカウンタの段階でカウントされます。線の希望数は（ すなわち 、ラスタースキャンが完了したとき）に達したときに、カウンタは、アクティブローインテグレータのためのリセットパルスを生成するためにシュミットトリガを駆動するパルスを、"実行"を生成する。このカウンタをリセットし、オペアンプの積分器の両方は、次のサイクルのために回路の準備を進め。適切なコンポーネントの選択は、ラスタのさまざまなサイズのこの回路は広範囲に適用できます。これは、実装は1つだけです。多数の他の実装も可能であり、特定の状況下で優先されることがあります。また、この回路は、Matroxの画像取込装置のカードで使用するために設計されています自動的に検出し、正しいイメージの段階の、。回路は他のframegrabbersで使用する場合は、位相補正回路やソフトウェアが必要になる場合があります。 この画像のフルサイズバージョンを表示するにはここをクリック。 一貫性のある繊維束を介して図4。画像の伝送。この回路図では、バンドルのいずれかの側のレンズは、繊維束の入力だけでなく、繊維束の出力上の画像を拡大するに投影された両方のイメージをスケーリングするためにあります。 図5 5軸マウントでマウントされている繊維束の例。小1"直径のアルミブロックは、画像の繊維束を挿入することができるように、退屈していた。繊維は、ボットでのアルミブロックの内側epoxiedした安定性のためのブロックのHは、上部と下部。 図6。添付microendoscopeで完成した顕微鏡システムのイメージ。ダイクロイックミラー後の放射ビームのパスは赤線として描画されている間より光路を可視化するために、励起ビームのパスは、青色で描画されます。 図7。ビデオレート共焦点走査顕微鏡システムによって生成されたサンプル画像。暗い小文字の"m"は、白い名刺の明るい蛍光のバックグラウンドに表示されます。

Discussion

このビデオレートでの撮像システムは、約8 kHzで動作する共振ガルバノミラーを利用しています。フルパワーで実行すると共振ミラーは非常に大きいです、そしてその高いピッチは十分な露光時間で厄介な、あるいは危険なことができます。ここに示されていないが、それが大幅にシステムボリュームおよび/またはそのような耳栓のような適切な聴力保護具を着用することを減らすために透明なケース内の共振ガルバノミラーを保護することをお勧めします。

共振ガルバノミラーは、正弦波パターンでスキャンします。しかし、フレームグラバカードは、両方の水平および垂直方向に完全にリニア掃引速度を仮定して信号を読み込む。正弦波スイープは、スキャンの端で速度が低下するので、画像圧縮アーチファクトは、高速（水平）画像の軸に沿って観察することができます。この問題を最小限にする一つの方法は、意図的に共振ガルバノミラーの走査範囲を駆動するよりもはるかに大きいです。リレーレンズの直径。こうすることで、正弦波走査パターンののみ、ほぼ直線の中央スイープは、画像の歪みを最小限に抑え、サンプルを通過します。もう一つのアプローチは、高速軸を線形化するポストプロセス、収集画像になります。これは、イメージングで公知の蛍光パターンを（gridなど）で実現し、収集した画像をunwarps処理のスクリプトを作成するには、既知のパターンの寸法を使用することができます。

この特定のスキャンシステムは、多くの場合、直立型ビデオレートでの顕微鏡を必要とするin vivoイメージング、 内の目的のために設計されました。細胞イメージング実験のために、倒立顕微鏡は、より一般的に使用されています。ここで紹介する設計は、簡単にそのような倒立顕微鏡を構築するために変更することができます。必要なことは、最後の2"直径のミラーの回転です。代わりに下に走査ビームを指示するために鏡を向けると、ミラーが上にビームを指示することができます。対物レンズの配置トン試料ステージと一緒にミラーから同じ距離には、反転幾何学でのイメージングが可能になります。イメージングシステムはmicroendoscopicイメージングのためだけに構築されている場合は、すべてで垂直に顕微鏡のデザインを"折り"する理由はありません。代わりに、全体のスキャンシステムは、光学テーブルに対物レンズ平行に配向を持つ単一の水平のブレッドボード上に構築することができます。

これはほとんどの市販の共焦点顕微鏡で見ることができるように、より汎用性の高いシステムを希望するユーザーは、変数ピンホールを組み込んだ検討するかもしれない、最大のビルドのシンプルさと位置合わせを容易にするために提供しながら、このビルドの顕微鏡は、固定ピンホールの設定を使用していることに注意してください。ユーザーは、発光強度を変化させるサンプルを補うためにピンホールの大きさを調整できるようにすることで、これは、ユーザーがより良い特定のサンプルのシグナルの強さと解像度の間のトレードオフを最適化することができます。

CH顕微鏡用に選択したイメージファイバのOICEは重要です。我々は彼らの近くにファイバのコアの間隔と低相対自己蛍光に起因する住友のコヒーレント画像の繊維を使用することをお勧めします。フジクラ製の画像繊維は、サンプルからの微弱な蛍光シグナルを圧倒し、microendoscopeの究極の感度を制限することができます自家蛍光¹⁰の高い量を、有することが見出された。そのようなこの特定のセットアップで使用される8 – 30Nとして住友製造された繊維は、、彼らのフジクラ同等物よりもはるかに低い自家蛍光レベルがあります。 leeched繊維束がmicroendoscopyにとって魅力的と見なされるかもしれないが、彼らのデザインは、通常、ファイバコアのまばらなサンプルオブジェクトは、潜在的な関心の重要な地域を残していることを意味し、離れすぎて個々のファイバーのコアを配置します。

最後に、それは顕微鏡がここで説明しながら、in vitroおよび in vivoアプリケーションシート内の様々な有用になることに注意してくださいアドオンとは、フル機能の商用システムの数分の一のコストのために作成することができます、それはそのような透過光を検出、表示するための接眼レンズ、または非共焦点広視野落射蛍光用ビームのパスなどの機能を持っていません。それは最初からこれらの機能を持つシステムを構築することは可能ですが、そのようなシステムを希望する読者は彼らのニーズを満たすのではなく、完全に新しいビルドを開始するために、既存の商用システムを変更したいこともあるかもしれません。

Materials

Part Name	Manufacturer	Item Number	Specifications	Quantity
515 nm Band Pass Filter	Chroma	HQ515/50M	46 FWHM	1
Achromatic Doublet Lens 25.4mm Dia. x 50mm FL, MgF2 Coating	Edmund Optics	NT49-766		1
Achromatic Doublet Lens 25.4mm Dia. x 76.2mm FL, MgF2 Coating	Edmund Optics	NT49-768		1
Achromatic Doublet Lens 25.4mm Dia. x 88.9mm FL, MgF2 Coating	Edmund Optics	NT49-769		2
Achromatic Doublet Lens 50mm Dia. x 300mm FL, MgF2 Coating	Edmund Optics	NT45-179		1
8 kHz R High Frequency Optical Scanner	Electro-Optical Products Corporation (EOPC)	SC-30	8 kHz	1
AGC Driver	Electro-Optical Products Corporation (EOPC)	ACG:8K
H7422-PA Photosensor Module	Hamamatsu	H7422-PA	Current limiting recommended	1
M9012 Power Supply	Hamamatsu	M9012	For use with H7422-PA	1
HC PL APO CS Objective	Leica	11506284	10x/0.40	1
Solios eA/XA Framegrabber Card	Matrox	Solios eA/XA	MIL software required; OEM interconnects recommended	1
12V Power Supply	Meanwell	LPV-100-12	+12V, 8.5A	1
5x Microscope Objective Lens	Newport	M-5X	0.10 NA, 25.4 mm Focal Length	1
Coherent Image Fiber	Sumitomo	8-30N		1
1/4″-20 Cap Screw and Hardware Kit	ThorLabs	HW-KIT2		1
100 μm Mounted Pinhole	ThorLabs	P100S	Ideal for building spatial filters	1
30 mm Cage Cube Clamp	ThorLabs	B6C		1
30 mm Cage System Cube, 4-Way	ThorLabs	C4W		1
406 nm, 5 mW, B Pin Code, SM Fiber Pigtailed Laser Diode, FC/PC	ThorLabs	LPS-406-FC	Product obsolete; replaced by LP405-SF10	1
5-Minute Epoxy, 1 Ounce	ThorLabs	G14250		1
6 Axis Kinematic Optic Mount	ThorLabs	K6X		1
8-32 Cap Screw and Hardware Kit	ThorLabs	HW-KIT1		1
8-32 Setscrew and Hardware Kit	ThorLabs	HW-KIT3		1
Adapter with External RMS Threads and Internal SM1 Threads	ThorLabs	SM1A4		1
Adj. FC/PC and FC/APC Collimator, f = 2.0 mm, ARC: 400-600 nm	ThorLabs	CFC-2X-A	f = 2.0 mm	1
Adjustable Fiber Collimator Adapter, SM1 Threaded	ThorLabs	AD9.5F		1
Aluminum Breadboard, 12″ x 18″ x 1/2″	ThorLabs	MB1218	1/4″-20 Threaded	2
Benchtop Laser Diode/TEC Controller	ThorLabs	ITC4001	1 A/96 W	1
DMLP 425 nm Long-Pass Dichroic Mirror	ThorLabs	DMLP425		1
Kinematic Mount for Ø1″ Optics	ThorLabs	KM100		3
LD/TEC Mount for ThorLabs Fiber-Pigtailed Laser Diodes	ThorLabs	LM9LP		1
Lens Mount for Ø18 mm Optics	ThorLabs	LMR18	One retaining ring included	1
Lens Mounts for 2″ Optics	ThorLabs	LMR2S	With internal and external threading; retainer ring included	2
Mini Series Cage Assembly Rod, 6″ Long, Ø4 mm, Qty. 1	ThorLabs	SR6		4
Ø1.0″ Pedestal Pillar Post, 8-32 Taps, 1″ Long	ThorLabs	RS1P8E		4
Ø1″ Pillar Post Extension, Length=0.5	ThorLabs	RS05		4
Ø1″ Pillar Post Extension, Length=0.75″	ThorLabs	RS075		4
Ø1″ Protected Silver Mirror, 3.2 mm Thick	ThorLabs	ME1-P01		1
Ø1″ SM1 Rotating Adjustable Focusing Element, L = 1″	ThorLabs	SM1V10		1
Ø2″ Protected Silver Mirror, 3.2 mm Thick	ThorLabs	ME2-P01		2
P100S – Ø100 μm Mounted Pinhole	ThorLabs	P100S		1
Polaris Low Drift Ø1″ Kinematic Mirror Mount	ThorLabs	POLARIS-K1	Low drift	1
SM1 Lens Tube, L = 1″	ThorLabs	SM1L-10	One retaining ring included	4
SM1 Threaded 30 mm Cage Plate, 0.35″ Thick	ThorLabs	CP02		2
SM1 to M25 Optical Component Threading Adaptor	ThorLabs	SM1A24	External SM1 Threads and Internal M25.5×0.5 Threads	1
Small Beam Diameter Galvo System	ThorLabs	GVSM001		1
Small Clamping Fork	ThorLabs	CF125	1/25″ counterbored slot, universal	15
Spatial Filter System	ThorLabs	KT310	Pinhole sold separately	1
TE-Cooled Mount for 5.6 & 9 mm Lasers	ThorLabs	TCLDM9		1
Vertical Bracket for Breadboards	ThorLabs	VB01	Each	2
Plan-Apochromat	Zeiss	1101-957	20x/0.75 NA	1