डीएनए प्रतिकृति के विज़ुअलाइज़ेशन हड्डीवाला मॉडल प्रणाली DT40 में डीएनए फाइबर तकनीक का उपयोग
Summary
DT40, एक मॉडल हड्डीवाला आनुवंशिक प्रणाली, प्रोटीन समारोह का विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है. यहाँ हम एक सरल तरीका है कि पैरामीटर है कि एक अणु के स्तर पर DT40 कोशिकाओं में एस चरण के दौरान डीएनए संश्लेषण को प्रभावित करने के गुणात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है का वर्णन.
Abstract
Maintenance of replication fork stability is of utmost importance for dividing cells to preserve viability and prevent disease. The processes involved not only ensure faithful genome duplication in the face of endogenous and exogenous DNA damage but also prevent genomic instability, a recognized causative factor in tumor development.
Here, we describe a simple and cost-effective fluorescence microscopy-based method to visualize DNA replication in the avian B-cell line DT40. This cell line provides a powerful tool to investigate protein function in vivo by reverse genetics in vertebrate cells1. DNA fiber fluorography in DT40 cells lacking a specific gene allows one to elucidate the function of this gene product in DNA replication and genome stability. Traditional methods to analyze replication fork dynamics in vertebrate cells rely on measuring the overall rate of DNA synthesis in a population of pulse-labeled cells. This is a quantitative approach and does not allow for qualitative analysis of parameters that influence DNA synthesis. In contrast, the rate of movement of active forks can be followed directly when using the DNA fiber technique2-4. In this approach, nascent DNA is labeled in vivo by incorporation of halogenated nucleotides (Fig 1A). Subsequently, individual fibers are stretched onto a microscope slide, and the labeled DNA replication tracts are stained with specific antibodies and visualized by fluorescence microscopy (Fig 1B). Initiation of replication as well as fork directionality is determined by the consecutive use of two differently modified analogues. Furthermore, the dual-labeling approach allows for quantitative analysis of parameters that influence DNA synthesis during the S-phase, i.e. replication structures such as ongoing and stalled forks, replication origin density as well as fork terminations. Finally, the experimental procedure can be accomplished within a day, and requires only general laboratory equipment and a fluorescence microscope.
Protocol
Discussion
हम एक तरीका है कि पैरामीटर है कि एक अणु के स्तर पर एस चरण के दौरान डीएनए संश्लेषण को प्रभावित करने के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है का वर्णन. पिछले दस वर्षों में, डीएनए फाइबर fluorography तकनीक के विभिन्न संस्करणों के लिए जीवित कोशिकाओं के भीतर अलग – अलग प्रतिकृति कांटे की आंदोलन की कल्पना करने के लिए विकसित किए गए. इन सभी तकनीकों में महत्वपूर्ण पैरामीटर कांच अच्छी तरह से अलग डीएनए फाइबर प्रदान सतहों पर डीएनए के सर्वश्रेष्ठ खींच संभव प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया प्रक्रिया है. इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम के रूप में के रूप में अच्छी तरह से lysis समय खुर्दबीन स्लाइड पर सेल निलंबन के ऊष्मायन समय है. इन मानकों और एक विशेष प्रयोगशाला में तापमान airflow पर निर्भर करती है और empirically निर्धारित किया जाना चाहिए. एक डीएनए फाइबर प्रयोग के व्यावहारिक हिस्सा आम तौर पर एक दिन के भीतर पूरा किया है. हालांकि, बाद में चित्र के अधिग्रहण और विश्लेषण और अधिक समय लगता है और अभ्यास की आवश्यकता है.
लेबलिंग प्रोटोकॉल विज्ञापन किया जा सकता हैविभिन्न वैज्ञानिक समस्याओं के जवाब apted: एक एजेंट है कि दूसरी पल्स लेबलिंग के दौरान प्रतिकृति के साथ हस्तक्षेप का उपयोग कर कांटा बढ़ाव / replicative तनाव के जवाब में रोकने पर नज़र रखता है. इस परिदृश्य में, पहले लेबल दूसरा nucleotide के रूप में बाहर धोया जा अधिक की जरूरत नहीं है में जोड़ा जाता है. वैकल्पिक रूप से, दवाओं है कि प्रतिकृति बाधित संयोजन में या बस से पहले लेबल के अलावा के बाद इस्तेमाल किया जा सकता है. यह पहले लेबल की आवश्यकता होती है और दूसरी nucleotide एनालॉग से पहले हटाया जा दवा लागू किया जाता है. यह प्रक्रिया एक replicative कांटा / replicative तनाव की शर्तों (यानी कांटा रोकने और / या पतन) के तहत स्थिरता वसूली पर विभिन्न डीएनए की मरम्मत कारकों के महत्व को निर्धारित करने के लिए अनुमति देता है. उल्लेखनीय डीएनए प्रतिकृति कार्यक्रम के विवरण की एक अधिक विस्तृत विश्लेषण एक वैकल्पिक दृष्टिकोण में तलाशी डीएनए और प्रतिदीप्ति स्वस्थानी संकरण के संयोजन के उपयोग के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है है. यह तथापि, तकनीकी और अधिक चुनौतीपूर्ण है और खर्च की आवश्यकताsive उपकरण.
गुणात्मक और मात्रात्मक डीएनए प्रतिकृति के विवरण का विश्लेषण करने की क्षमता ही डीएनए प्रतिकृति में दोष के रूप में के रूप में अच्छी तरह रास्ते में है कि जीनोमिक प्रतिकृति कांटे के साथ जुड़े अस्थिरता को दबाने की जांच के लिए एक आवश्यक उपकरण प्रदान करता है. निस्संदेह, इस परख आगे प्रतिकृति की मध्यस्थता डीएनए की मरम्मत के तंत्र है कि सामान्य कोशिकाओं को जवाब / पर्यावरण परिवर्तन के रूप में कैसे कैंसर की कोशिकाओं को इन तंत्रों का उपयोग करने के लिए प्रतिकृति कांटे लक्ष्यीकरण दवाओं की विषाक्तता का विरोध के रूप में अच्छी तरह से अनुकूलित की अनुमति पर प्रकाश डाला मदद मिलेगी.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम फाइबर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से तकनीक उपयोगी चर्चा के लिए प्रयोगशाला के सदस्यों के साथ मदद के लिए डॉ. टी. Helleday और डॉ. ई. Petermann धन्यवाद. WN एक वरिष्ठ अंतर्राष्ट्रीय कैंसर अनुसंधान के लिए एसोसिएशन से इंटरनेशनल रिसर्च फैलोशिप और वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान (१,६५,९३५ N301) पोलिश राज्य समिति द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Fetal bovine serum gold (FBS) | PAA | A15-151 | |
| Chicken serum | Sigma | C5405 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA | P11-010 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| 5-Iodo-2′-deoxyuridine (IdU) | Sigma-Aldrich | I7125 | |
| 5-Chloro-2′-deoxy-uridine (CldU) | Sigma | C6891 | |
| Microscope slides SuperFrost | VWR | 631-0910 | |
| Cover slips No1 | Scientific lab suppplies | MIC3234 | |
| Vectashield mounting medium | H-1000 Vector lab | H-1000 | |
| Anti-BrdU antibody (mouse) | BD Biosciences | 347580 | |
| Anti-BrdU antibody (rat) | Abcam | ab6326 | |
| sheep anti-mouse Cy3 | Sigma | C2181 | |
| goat anti-rat Alexa Fluor 488 antibody | Invitrogen | A110060 | |
Riferimenti
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