Un método para etiquetar los Vasos sanguíneos en embriones de ratones
Summary
En este artículo se describe un método para el etiquetado de la piel embrionaria y los vasos sanguíneos del timo.
Abstract
El establecimiento de una red de vasos sanguíneos funcionales es una parte esencial de la organogénesis, y es necesario para la función del órgano óptimo. Por ejemplo, en la formación de la vasculatura del timo y el patrón adecuado es esencial para la entrada en el órgano de timocitos y células T maduras salida a la periferia. La disposición espacial de los vasos sanguíneos en el timo depende de señales del microambiente local, es decir, las células epiteliales del timo (TEC). Varios informes recientes sugieren que la interrupción de las señales de estos resultados en un recipiente de 1,2 defectos timo sangre. Estudios previos han descrito técnicas que se utilizan para etiquetar los 1,2 timo vasculatura neonatal y de adultos. Se demuestra aquí una técnica para el etiquetado de los vasos sanguíneos en el timo embrionario. Este método combina el uso de FITC-dextrano o Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lectina I (GSL 1 – isolectina B 4) inyecciones faciales vena y CD31 tinción de anticuerpos para identificar las estructuras vasculares del timo y PDGFR-β a la etiqueta del timo mesénquima perivascular 3-5. La opción de utilizar cryosections o secciones vibratome también se proporciona. Este protocolo se puede utilizar para identificar el timo defectos vasculares, lo cual es crítico para la definición de los roles de TEC-moléculas derivadas del timo en la formación de vasos sanguíneos. Como el método de las etiquetas de todo el sistema vascular, también puede ser utilizado para analizar las redes vasculares en múltiples órganos y tejidos en todo el embrión, incluyendo la piel y el corazón de 6-10.
Protocol
Discussion
Todo el montaje y PECAM-1 (CD31) en las secciones de tinción son los métodos convencionales para el etiquetado de la vasculatura en embriones de ratones. Estos métodos requieren el uso de la inmunofluorescencia directa y / o indirecta, y los detergentes para permeabilizar los tejidos del ratón. Este resulta ser un proceso más oportuna. En este caso, hemos empleado FITC-dextrano o isolectina B 4 inyecciones vena facial para etiquetar directamente la vasculatura embrionaria, eliminando así la necesidad de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por los números de concesión y R01AI055001 R01AI082127 del NIAID para MRN y Tesis SREB Beca de JLB.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| FITC-dextran | Sigma | FD150S-1G |
| Fluorescein labeled GSL 1 – isolectin B4 | Vector Laboratories | FL-1201 |
| Fast Green | MP Biomedicals | 195178 |
| PFA | Fluka | 76240 |
| Fetal Bovine Serum | Atlanta Biologicals | S11550 |
| Optimal Cutting Temperature Compound (O.C.T. | VWR | 25608-930 |
| Acetone | JT Baker | 9006-33 |
| Donkey Serum | Jackson | 017-000-121 |
| rat anti-mouse CD31, | BD Pharmingen | 558736 |
| goat anti-mouse PDGFR-β | R&D Systems | AF1042 |
| donkey anti-rat CD31 Alexa 647 (Invitrogen) | Biolegend | 102516 |
| donkey anti-goat Alexa 594 (Invitrogen) | Invitrogen | A11058 |
| Triton X -100 | Sigma-Aldrich | X-100 |
| Low melt agarose/PBS | Sigma-Aldrich | A9414-25G |
| Methanol | Fisher Scientific | A413-4 |
| Benzyl Alcohol | Acros Scientific | 148390010 |
| Benzyl Benzoate | Acros Scientific | 105860010 |
| Depression slides | Fisher Scientific | S175201 |
| Fluorogel | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 |
| Cover Glass (22X22)-1.5 | Thermo Scientific | 152222 |
| Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope | Zeiss | |
| Micro dissecting forceps | Roboz | RS-5135 |
| Parafilm No. OM992 | Fisher Scientific | 13-374-16 |
| 12 and 24 well microplates | Evergreen Scientific | 222-8044-01F |
| Superfrost/Plus Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 |
| 4mL clear vials | National Scientific | B7800-2 |
Riferimenti
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