Questo articolo descrive un metodo per l'etichettatura di pelle embrionale e vasi sanguigni timo.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Un metodo per l'etichettatura vasi embrionali nei topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
La creazione di una rete funzionale vaso sanguigno è una parte essenziale di organogenesi, ed è necessario per il funzionamento ottimale degli organi. Per esempio, nella formazione timo corretta vascolarizzazione ed il modello è indispensabile per l'ingresso timocita nell'organo e maturo delle cellule T uscita alla periferia. La disposizione spaziale dei vasi sanguigni nel timo dipende segnali provenienti dal microambiente locale, cioè le cellule epiteliali timiche (TEC). Diversi rapporti recenti suggeriscono che la perturbazione di questi risultati segnali in timo vaso sanguigno 1,2 difetti. Studi precedenti hanno descritto le tecniche utilizzate per etichettare il neonatale e adulto vascolarizzazione del timo 1,2. Si dimostra qui una tecnica per l'etichettatura dei vasi sanguigni nel timo embrionale. Questo metodo combina l'uso di FITC-destrano o Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia lectina I (GSL 1 - isolectin B 4) iniezioni vena facciale e CD31 colorazione anticorpi per identificare timo strutture vascolari e PDGFR-β per etichettare timo mesenchima perivascolare 3-5. La possibilità di utilizzare criosezioni o sezioni vibratome inoltre è fornita. Questo protocollo può essere utilizzato per identificare timo difetti vascolari, che è fondamentale per definire i ruoli di TEC-molecole derivate timo nella formazione dei vasi sanguigni. Come metodo di etichette intero sistema vascolare, può anche essere usato per analizzare le reti vascolari in molti organi e tessuti in tutto l'embrione tra pelle e cuore 6-10.
Protocollo
1. Fluorescina etichettata destrano e GSL I-isolectin B 4 iniezioni vena facciale per etichettare vasi embrionali
- Preparare FITC-destrano (50ug/mL) in soluzione tampone fosfato (PBS) o GSL 1 - isolectin B 4 (20ug/200uL) in PBS in un tubo Eppendorf 1,5 ml e caldo a 37 ° C. Aggiungi 100uL di magazzino 1,25 mm Fast Green / PBS al FITC-destrano soluzione (volume totale 1 ml) e 180uL di azioni da 1,25 mm Fast Green / PBS per la GSL 1 - isolectin B 4 (200uL volume totale), in modo che la soluzione è visibilmente blu.
- Sezionare E14.5 E18.5-embrioni e sacco vitellino insieme, lasciando il gambo allantoide (arteria e vena ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
Whole-mount e PECAM-1 (CD31) colorazione sulle sezioni sono i metodi convenzionali per l'etichettatura del sistema vascolare nei topi embrionale. Questi metodi richiedono l'uso di immunofluorescenza diretta e / o indiretta, e detergenti per permeabilize tessuto del mouse. Questo risulta essere un processo piuttosto tempestivo. Qui, abbiamo impiegato FITC-destrano o isolectin B 4 iniezioni vena facciale per etichettare direttamente la vascolarizzazione embrionali, eliminando così la necessità di fasi d.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dai numeri concedere R01AI055001 e R01AI082127 dal NIAID di NRM e Premio tesi SREB Fellowship di JLB.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | |
| FITC-destrano | Sigma | FD150S-1G | |
| Fluorescina etichettata GSL 1 - isolectin B 4 | Laboratori Vector | FL-1201 | |
| Fast Green | MP Biomedicals | 195178 | |
| PFA | Fluka | 76240 | |
| Siero bovino fetale | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Temperatura ottimale composto da taglio (OCT | VWR | 25608-930 | |
| Acetone | JT Baker | 9006-33 | |
| Donkey Siero | Jackson | 017-000-121 | |
| topo anti-topo CD31, | BD Pharmingen | 558736 | |
| capra anti-topo PDGFR-β | R & D Systems | AF1042 | |
| asino anti-ratto CD31 Alexa 647 (Invitrogen) | Biolegend | 102516 | |
| asino anti-capra Alexa 594 (Invitrogen) | Invitrogen | A11058 | |
| Triton X -100 | Sigma-Aldrich | X-100 | |
| Bassa temperatura di fusione agarosio / PBS | Sigma-Aldrich | A9414-25G | |
| Metanolo | Fisher Scientific | A413-4 | |
| L'alcol benzilico | Acros scientifico | 148390010 | |
| Benzyl Benzoate | Acros scientifico | 105860010 | |
| Depressione diapositive | Fisher Scientific | S175201 | |
| Fluorogel | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Copertura di vetro (22x22) -1,5 | Thermo Scientific | 152222 | |
| Zeiss LSM 510 Meta microscopio confocale | Zeiss | ||
| Micro dissettore | Roboz | RS-5135 | |
| Parafilm No. OM992 | Fisher Scientific | 13-374-16 | |
| 12 e 24 micropiastre bene | Evergreen scientifico | 222-8044-01F | |
| SuperFrost / Plus Microscopio Slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| 4 ml fiale chiaro | Scientifico Nazionale | B7800-2 |
Riferimenti
- Cuddihy, A. R. VEGF-mediated cross-talk within the neonatal murine thymus. Blood. 113, 2723-2731 (2009).
- Muller, S. M. Gene targeting of VEGF-A in thymus epithelium disrupts thymus blood vessel architecture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. ....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
