הקמנו פרוטוקול לזירוז של neuroblasts ישירה אנושי לתאי גזע עובריים pluripotent נשמר בתנאים מוגדרים עם מולקולות קטנות, המאפשרת גזירת אספקה גדולה של אבות העצבית האנושית העצבית תא סוגים של פיתוח עבור מערכת העצבים המרכזית העצבית לתיקון.
יש צורך גדול התגשמו מקור תא אנושי קליני מתאים העצבית לתיקון או התחדשות של מערכת נזק העצבים המרכזית (CNS) מבנה המעגלים בתעשיית הבריאות של היום. Cell טיפולים מבוססי לקיים הבטחה גדולה כדי להחזיר את תפקוד רקמת עצב אבוד בהפרעות מערכת העצבים המרכזית. עם זאת, טיפולים המבוססים על תאים CNS-derived בתאי גזע עצביים נתקלים הגבלת היצע קושי להשתמש בסביבה קלינית בשל היכולת הרחבה מוגבלת שלהם בתרבות פלסטיות נכשל לאחר 1-3 passaging נרחב. למרות כמה תוצאות מועילות, CNS-derived תאים אנושיים גזע עצביים (hNSCs) מופיעים להפעיל השפעות טיפוליות שלהם בעיקר על ידי progenies הלא העצבית שלהם באמצעות trophic בייצור מולקולות neuroprotective להציל את התאים אנדוגני 1-3. לחלופין, pluripotent בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) להציע תרופות למגוון רחב של הפרעות נוירולוגיות ידי supplying את המגוון של סוגי התאים האנושיים העצבית העצבים המרכזית פיתוח להתחדשות 1,4-7. עם זאת, איך לתעל את פוטנציאל התמיינות רחב של hESCs pluripotent ביעילות כצפוי על הפנוטיפ הרצוי כבר אתגר גדול עבור המחקר הן התפתחותיות תרגום קליניים. הגישות המקובלות להסתמך על הנטייה רב שושלת היוחסין של תאים pluripotent באמצעות בידול נבט ספונטנית שכבה, וכתוצאה מכך מחויבות-השושלת יעיל ובלתי נשלט זה מלווה לעתים קרובות ההטרוגניות יציבות פנוטיפי, ולכן, סיכון גבוה tumorigenicity 7-10. בנוסף, מוגדר תוספי ביולוגיים זרים / חיה ו / או ניזונים, כי יש בדרך כלל נעשה שימוש בבידוד, הרחבה, בידול של hESCs רשאי לעשות שימוש ישיר של תאים מיוחדים כגון שתלים בחולים בעייתי 11-13. כדי להתגבר על המכשולים הללו, אנחנו צריכים לפתור את האלמנטים של מערכת התרבות מוגדר הכרחי ומספיק sustaining pluripotence epiblast של hESCs, משמש כפלטפורמה הגזירה דה נובו של hESCs קלינית מתאימה ויעילה בימוי hESCs כזה אחיד כלפי שושלות קלינית רלוונטית על ידי מולקולות קטנות 14 (ראה סכמטית באיור. 1). חומצה רטינואית (RA) לא להשרות התמיינות נוירונים של hESCs מובחן שמרו על ניזונים 1, 14. ובניגוד ESCs עכבר, טיפול hESC-הבדיל גופים embryoid (EBS) רק מגביר במקצת את התשואה הנמוכה של נוירונים 1, 14, 15. עם זאת, לאחר הקרנת מגוון רחב של מולקולות קטנות, ובדרך גורמי גדילה, מצאנו כי התנאים שניתנו מוגדרים כגון חומצה רטינואית (RA) מספיק כדי לגרום את המפרט של neuroectoderm ישירה hESCs pluripotent כי עוד התקדם neuroblasts שהפיק אבות העצבית האנושית נוירונים CNS פיתוח עם יעילות גבוהה (איור 2). הגדרנו תנאים אינדוקציה של נוירוישיר hESCs pluripotent ללא שלב להתערב רב השושלת הגוף embryoid, המאפשר מבוקר היטב הגזירה יעיל של היצע גדול של תאים עצביים אדם מכל גווני הקשת של שלבי ההתפתחות של התא מבוסס הרפוי תקיעות.
אחד האתגרים הגדולים עבור המחקר הן התפתחותיות תרגום קליני כבר איך לתעל את פוטנציאל התמיינות רחב של pluripotent בתאי גזע אנושיים הפנוטיפ הרצוי ביעילות כצפוי. למרות תאים כאלה יכולים להבדיל באופן ספונטני במבחנה לתאים של כל שכבות הנבט ידי עובר שלב רב שושלת צבירה, רק חלק קטן של תאים להמשיך 1,4 השושלת נתון. באותם hESC הנגזרות אגרגטים, המראה בו זמנית של כמות ניכרת של מסתעף נרחב סוגי תאים לא רצויים אשר עשויים להימצא בתוך שלוש שכבות נבט עובריים לעתים קרובות הופך את הופעתה של פנוטיפים הרצוי לא רק לא יעילה, אבל בלתי נשלט ולא אמינה גם כן. למרות שושלות לב עצביים כבר נגזר בדוחות הקודמים, עם זאת, יעילות ביצירת תאים מיוחדים באמצעות אינדוקציה נבט-שכבה של תאים pluripotent לבין סיכון גבוה tumorigenicity הבאים transplantation יש הפריע התרגום קליניים נוספים.
הקווים hESC בתחילה נגזרו ומתוחזק בתרבות בשיתוף עם צמיחה נעצר עכבר fibroblasts עובריים (MEFs) 4. למרות מזין אנושי מספר, מזין חופשי, ומערכות תרבות כימי ניסח פותחו עבור 11-13 hESCs, האלמנטים הכרחי ומספיק לקיום העצמי התחדשות של תאים pluripotent אדם נותרו לא פתורות. תאים אלה מזין אקסוגניים ו ריאגנטים ביולוגיים לעזור לשמור על צמיחה ארוכת טווח יציבה של hESCs מובחן ואילו למסכה היכולת של התאים pluripotent להגיב על אותות התפתחותיים. שמירה hESCs מובחן במערכת ביולוגי ללא מוגדר תרבות המאפשר הרחבת נאמן בידול ישיר לשליטה הוא אחד המפתחות השירות הטיפולי שלהם ואת הפוטנציאל. RA לא היה די כדי לגרום בידול העצבית של hESCs מובחן נשמר תחת Condit בעבר דיווחיונים מזין המכיל תאים חיצוניים. למרות שושלות עצביים מופיעים בשלב מוקדם יחסית בידול hESC, טיפול hESC-הבדיל רב השושלת אגרגטים (גופים embryoid) עם RA גדל רק במעט את התשואה הנמוכה של נוירונים 1, 14, 15. על מנת להשיג אחיד ההמרה של אדם בתאי גזע pluripotent לשושלת מסוימת, אנחנו עובדים מערכת תרבות מוגדרת מסוגלים לבטח את הפצת hESCs מובחן לזהות תנאים לזירוז מבוקר היטב יעיל של hESCs pluripotent בלעדי מסוים בשושלת קליני רלוונטי על ידי הוראה פשוטה של מולקולות קטנות (איור 1, איור. 2). מחקרים עתידיים יגלה מולקולות בקרה גנטית epigenetic בהתפתחות מערכת העצבים המרכזית האדם חלופות, אשר עשוי לסלול את הדרך לשלוט מולקולה בתיווך קטן אפנון ישיר של גורל pluripotent hESC כאשר הנובעות שושלות קליני רלוונטי עבור טיפולים רגנרטיבית. ללא טיפול בדלקת מפרקים שגרונית, 1-5HESCs% יעברו התמיינות ספונטנית לתוך נוירונים 1, 14, 15. באמצעות טיפול בדלקת מפרקים שגרונית, הצלחנו לייצר> 95% אבות העצבית העוברית נוירונים מ hESCs שמרו תחת תרבות להגדיר בתהליך שעשוי לחקות ההתפתחות העוברית האנושית 14. לאחרונה, ידוע עצביים-בקביעת גורל גנים שימשו transdifferentiate fibroblasts העכבר לתוך אבות עצביים נוירונים בוגרים עם יעילות נמוכה בטווח 0.5-8% 17, 18. עם זאת, reprogrammed התאים הסומטיים יש היסטורית היה קשור ביטוי גנים חריגים הזדקנות מואצת עם התועלת הטיפולית לקויי 19-21. לבסוף, פרוטוקול הקמנו כאן מוגבל hESCs pluripotent נגזר מסת התאים הפנימית (ICM) או epiblast של הבלסטוציסט אדם 4, אינן חלות pluripotent תאים אחרים, כולל בעלי חיים שמקורם ESCs, ESCs נגזר מוקדם יותר morula (שמונה תאים) בשלב עוברי 22, ו artifתאים reprogrammed icially 23.
The authors have nothing to disclose.
XHP כבר נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (NIH) מענקי המכון הלאומי להזדקנות (NIHK01AG024496) ו יוניס קנדי שרייבר המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם (NIHR21HD056530).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Matrigel | BD bioscience | 356231 | Growth factor reduced |
Human laminin | Sigma | L6274 | |
all-trans-Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
DMEM/F12 | Invitrogen | 10565018 | |
DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
MEM amino acids solution (MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
Ascorbic acid | Sigma | A4403 | |
Human transferrin | Sigma | T8158 | |
Human bFGF | PeproTech | AF-100-18B | |
Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
Human activin A | PeproTech | 120-14E | |
Human BDNF | PeproTech | AF-450-02 | |
Human VEGF | PeproTech | AF-100-20 | |
Human NT-3 | PeproTech | 450-03 | |
Heparin | Sigma | H5284 | |
N-2 supplement (100X) | Invitrogen | 17502048 | |
6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
6-well plate | Corning | 3516 |