Vi har etablerat ett protokoll för induktion av neuroblaster direkt från pluripotenta mänskliga embryonala stamceller som upprätthålls enligt fastställda villkor med små molekyler, vilket möjliggör härledning av ett stort utbud av mänskliga neuronala stamceller och neuronala celltyper i utvecklingsländerna CNS för neurala reparation.
Det finns ett stort ouppfyllda behov av ett kliniskt lämpligt mänskliga neuronala celler källa för reparation eller förnyelse av de skadade centrala nervsystemet (CNS) struktur och kretsar i dagens sjukvården. Cellbaserade terapier är mycket lovande för att återställa förlorad nervvävnad och funktion för CNS-sjukdomar. Dock har cellterapi bygger på CNS härstammar-neurala stamceller stött på utbudet restriktioner och svårigheter att använda i klinisk miljö på grund av deras begränsade expansionen förmåga i kultur och i avsaknad av plasticitet efter omfattande passaging 1-3. Trots vissa positiva resultat, CNS-derived mänskliga neurala stamceller (hNSCs) förefaller utöva sina terapeutiska effekter främst genom sin icke-neuronala avkommor genom att producera trofiska och nervskyddande molekyler för att rädda den endogena celler 1-3. Alternativt pluripotenta mänskliga embryonala stamceller (hESCs) proffer botemedel för ett brett spektrum av neurologiska störningar av supplying den mångfald av mänskliga neuronala celltyper i utvecklingsländerna CNS för regenerering 1,4-7. Men hur har att kanalisera det stora differentiering potential pluripotenta hESCs effektivt och förutsägbart till en önskad fenotyp varit en stor utmaning för både utvecklings-studier och kliniska översättning. Konventionella metoder är beroende av flera härstamning lutning pluripotenta celler genom spontana könsceller lager differentiering, vilket resulterar i ineffektiva och okontrollerbar härstamning-engagemang som ofta följs av fenotypisk heterogenitet och instabilitet därmed en stor risk för tumorigenicitetsprov 7-10. Dessutom kan odefinierade utländska / djur biologiska kosttillskott och / eller matare som vanligen har använts för isolering, expansion och differentiering av hESCs direkt använder sådan cell-specialiserade kneg hos patienter problematiskt 11-13. För att övervinna dessa hinder, vi har löst delar av ett definierat kultur som är nödvändiga och tillräckliga för sustaining den epiblast pluripotence av hESCs, fungerar som en plattform för de novo härledning av kliniskt lämplig hESCs och effektivt styra ett sådant hESCs jämnt mot kliniskt relevant härstamningar av små molekyler 14 (se ett schema i bild. 1). Retinoinsyra (RA) inducerar inte neuronal differentiering av odifferentierade hESCs underhållas på matare 1, 14. Och till skillnad från mus ekonomiska och sociala råd, behandlar hESC differentierade embryoid organ (EBS) endast marginellt ökar låg avkastning av nervceller 1, 14, 15. Men, efter säkerhetskontroll en mängd små molekyler och tillväxtfaktorer, fann vi att dessa definierade villkor återges retinoinsyra (RA) är tillräcklig för att framkalla specifikationen av neuroectoderm direkt från pluripotenta hESCs att ytterligare utvecklats till neuroblaster som genereras mänskliga neuronala stamceller och nervceller i utveckla CNS med hög verkningsgrad (bild 2). Vi fastställda villkor för induktion av neuroblaster direkt från pluripotenta hESCs utan en mellanliggande flera härstamning embryoid kroppen skede, så välkontrollerad effektiv härledning av ett stort utbud av mänskliga neuronala celler inom hela spektrumet av utvecklingsstadier för cell-baserad terapi.
En av de stora utmaningar för både utvecklingsstudie och kliniska översättningen har varit att kanalisera de breda differentiering potential pluripotenta mänskliga stamceller till önskad fenotyp effektivt och förutsägbart. Även om sådana celler kan skilja spontant in vitro i celler av alla groddblad genom att gå igenom en flera härstamning samlade skede, bara en bråkdel av celler utöva ett visst släktskap 1,4. I de hESC-derived aggregat gör samtidiga en stor mängd vitt skilda oönskade celltyper som kan finnas i tre embryonala groddblad ofta uppkomsten av önskade fenotyper inte bara ineffektivt, men okontrollerbara och opålitliga också. Även hjärt-och neurala linjerna har härletts i tidigare rapporter, men ineffektiviteten generera specialiserade celler genom könsceller lager-induktion av pluripotenta celler och hög risk för tumorigenicitetsprov följande transplantation ha hindrat ytterligare kliniska översättning.
Den hESC linjer ursprungligen härstammar och underhålls i samarbete kultur med tillväxt-greps möss embryonala fibroblaster (MEFs) 4. Trots att flera människor feeder, matare-fri, och kemiskt formulerade system kulturen har utvecklats för hESCs 11-13, elementen är nödvändig och tillräcklig för att upprätthålla den självförnyelse för mänskliga pluripotenta celler förblir olösta. Dessa exogena feeder celler och biologiska reagens bidra till att upprätthålla långsiktigt stabil tillväxt av odifferentierade hESCs medan masken förmåga pluripotenta celler att reagera på utvecklings-signaler. Att upprätthålla odifferentierade hESCs i ett definierat biologiska-fri kultur som gör det möjligt trogna expansion och kontrollerbar direkt differentiering är en av nycklarna till deras terapeutiska nyttan och potential. RA var inte tillräcklig för att framkalla neuronal differentiering av odifferentierade hESCs upprätthålls enligt tidigare redovisade Conditjoner innehåller exogena feeder celler. Även om neurala linjer visas på ett relativt tidigt skede i hESC differentiering, behandla hESC differentierade flera härstamning aggregat (embryoid organ) med RA endast marginellt ökat den låga avkastningen av nervceller 1, 14, 15. För att uppnå enhetligt konvertering av mänskliga pluripotenta stamceller till en viss härstamning, anställde vi en definierad kultur system som kan försäkra spridning av odifferentierade hESCs att identifiera förutsättningar för välkontrollerade effektiv induktion av pluripotenta hESCs enbart till ett visst kliniskt relevant härstamning genom en enkel tillhandahållande av små molekyler (Fig. 1, Fig.. 2). Framtida studier kommer att avslöja genetiska och epigenetiska kontroll molekyler i människans CNS utveckling som alternativ, vilket kan bana väg för liten molekyl-medierad direkt kontroll och modulering av hESC pluripotenta öde när härrör kliniskt relevanta linjer för regenerativ terapi. Utan RA behandling, 1-5% HESCs kommer att genomgå spontan differentiering till nervceller 1, 14, 15. Med RA behandling, har vi kunnat generera> 95% embryonala neuronala stamceller och nervceller från hESCs bibehålls som ett definiera kulturen i en process som kan efterlikna mänskliga embryonala utvecklingen 14. Nyligen har känt neurala-ödet bestämma gener använts för att transdifferentiate musfibroblaster i vuxen neurala stamceller och nervceller med en låg verkningsgrad på mellan 0,5-8% 17, 18. Dock har omprogrammeras kroppsceller historiskt förknippats med onormalt genuttryck och accelererat åldrande med nedsatt terapeutiska nyttan 19-21. Slutligen är det protokoll som vi etablerat här begränsat till pluripotenta hESCs härrör från den inre cellmassan (ICM) eller epiblast av den mänskliga blastocysten 4 får inte tillämpas på andra pluripotenta celler, inklusive djur har sitt ursprung ekonomiska och sociala råd, ekonomiska och sociala råden från tidigare Morula (åtta -cell)-stadiet embryon 22, och Artificially omprogrammerade celler 23.
The authors have nothing to disclose.
XHP har fått stöd av National Institute of Health (NIH) anslag från National Institute on Aging (NIHK01AG024496) och The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health och Human Development (NIHR21HD056530).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Matrigel | BD bioscience | 356231 | Growth factor reduced |
Human laminin | Sigma | L6274 | |
all-trans-Retinoic acid | Sigma | R2625 | |
DMEM/F12 | Invitrogen | 10565018 | |
DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
MEM amino acids solution (MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
Ascorbic acid | Sigma | A4403 | |
Human transferrin | Sigma | T8158 | |
Human bFGF | PeproTech | AF-100-18B | |
Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
Human activin A | PeproTech | 120-14E | |
Human BDNF | PeproTech | AF-450-02 | |
Human VEGF | PeproTech | AF-100-20 | |
Human NT-3 | PeproTech | 450-03 | |
Heparin | Sigma | H5284 | |
N-2 supplement (100X) | Invitrogen | 17502048 | |
6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
6-well plate | Corning | 3516 |