أقمنا على بروتوكول لتحريض مباشر من cardioblasts المحفزة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في ظل ظروف محددة المحافظة مع الجزيئات الصغيرة ، والتي تمكن من اشتقاق كميات كبيرة من أسلاف الإنسان والقلب العضلية وظيفية لإصلاح القلب والأوعية الدموية.
حتى الآن ، كان عدم وجود مصدر الخلايا البشرية المناسبة لنكسة كبيرة في القلب في الإنسان تجديد عضلة القلب ، وإما عن طريق زرع خلية القاعدة أو أنسجة القلب 1-3 الهندسية. العضلية تصبح عضال ، متباينة بعد وقت قصير من الولادة ، وتفقد قدرتها على التكاثر. لا يوجد أي دليل على أن الجذعية / السلف الخلايا المشتقة من مصادر أخرى ، مثل نخاع العظم أو دم الحبل السري ، قادرة على أن تؤدي الى خلايا عضلة القلب مقلص التالية زرع في قلب 1-3. لم تكن الحاجة إلى تجديد أو إصلاح عضلة القلب التالفة التي اجتمع الكبار العلاج بالخلايا الجذعية ، سواء المحلية أو عبر تسليم خلية 1-3. ومستقرة وراثيا الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) وغير محدود القدرة على التوسع واللدونة غير مقيدة ، يقترحونها خزان المحفزة للاشتقاق في المختبر من كميات كبيرة من الخلايا الجسدية البشرية التي تقتصر على النسب في حاجةإصلاح وتجديد 4،5. نظرا لانتشار مرض القلب والأوعية الدموية في جميع أنحاء العالم والنقص الحاد في الأجهزة المانحة ، وهناك اهتمام كبير في العلاجات القائمة على hESC النامية كنهج بديل. ومع ذلك ، وكيفية التفريق قناة إمكانات واسعة من hESCs المحفزة بكفاءة ويمكن التنبؤ بها إلى النمط الظاهري المطلوب قد يشكل تحديا كبيرا لكلا دراسة تنموية والترجمة السريرية. المناهج التقليدية تعتمد على نسب متعددة من الخلايا المحفزة الميل التلقائي من خلال تمايز طبقة الجرثومية ، مما أدى إلى عدم كفاءة والتزام لا يمكن السيطرة عليها ، النسب التي يتم اتباعها في كثير من الأحيان عدم التجانس المظهري وعدم الاستقرار ، وبالتالي ارتفاع مخاطر tumorigenicity 6-8 (انظر التخطيطي في الشكل 1A). بالإضافة إلى ذلك ، قد غير معروف ملاحق البيولوجية الأجنبية / الحيوانية و / أو مغذيات التي عادة ما كانت تستخدم للعزل ، والتوسع ، والتفريق بين hESCs الاستفادة مباشرة من هذه الخلية specialiزيد الطعوم في المرضى الذين يعانون مشاكل 9-11. للتغلب على هذه العقبات ، ولقد عقدنا العزم على عناصر نظام ثقافة المعرفة الضرورية والكافية لإدامة الأديم الظاهر pluripotence من hESCs ، بمثابة منصة لاشتقاق نوفو دي hESCs سريريا مناسب وفعال توجيه مثل هذه hESCs موحد تجاه الأنساب سريريا ذات الصلة بواسطة الجزيئات الصغيرة 12 (انظر التخطيطي في الشكل 1B). بعد فحص مجموعة متنوعة من الجزيئات الصغيرة وعوامل النمو ، وجدنا أن هذه الشروط المحددة المقدمة نيكوتيناميد (NAM) كافية للحث على مواصفات cardiomesoderm مباشرة من hESCs المحفزة التي تقدم المزيد من cardioblasts التي ولدت مع الإنسان العضلية الضرب كفاءة عالية (الشكل 2 ). حددنا الشروط لتحريض مباشر من cardioblasts hESCs المحفزة دون التدخل المتعدد نسب مضغي الشكل مرحلة الجسم ، وكذلك تمكين لسيطرة فعالة على الاشتقاقكميات كبيرة من خلايا القلب البشرية عبر الطيف من المراحل التنموية لخلية مقرها المداواة.
كان واحدا من التحديات الكبرى على حد سواء دراسة تنموية والترجمة السريرية كيفية توجيه إمكانات واسعة من تمايز الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان إلى النمط الظاهري المطلوب بكفاءة ويمكن التنبؤ به. على الرغم من أن مثل هذه الخلايا يمكن التفريق بصورة عفوية إلى خلايا في المختبر من كل الطبقات الجرثومية التي تمر في مرحلة تجميع متعددة النسب ، في hESC المستمدة متعددة النسب المجاميع (الهيئات مضغي الشكل) ، سوى جزء صغير جدا من الخلايا (<2 ٪) بشكل عفوي تفرق في العضلية 13-15 (الشكل 1A). انتقاء مناعي التالية ، كانت من أثرى السكان العضلية قادرة على العمل وأجهزة ضبط نبضات القلب البيولوجي لانقاذ ظيفة عضلة القلب التالفة ميكانيكيا والكترونيا بعد حقنها في قلب النماذج الحيوانية 13. في النماذج احتشاء القوارض ، تم engrafted hESC المستمدة السلالات القلب قادرة على البقاء وناضجة تصل إلى 12 أسبوعا ، وremuscular جزئياإيزي قلب المصابين وتحسين وظيفة مقلص 14،15. ومع ذلك ، فقد أعاق انعدام الكفاءة في توليد الإنسان التي ارتكبت في القلب ، من خلال خلايا متعددة النسب تمايز الخلايا المحفزة ومخاطر عالية من زرع مزيد من الترجمة التالية tumorigenicity السريرية. وضع استراتيجيات لتوجيه إمكانات واسعة من تمايز hESCs المحفزة وحدها ، ويمكن التنبؤ بها إلى النمط الظاهري القلب هو أمر حيوي لتسخير قوة البيولوجيا hESC في مجال القلب. استخدمنا من أجل تحقيق تحويل موحد للخلايا الجذعية المحفزة لنسب معينة ، وهو نظام قادر على تعريف الثقافة تأمين انتشار hESCs غير متمايزة لتحديد الظروف التي تسيطر عليها بشكل جيد للتحريض كفاءة hESCs المحفزة حصرا على وجه الخصوص النسب ذات الصلة سريريا عن طريق توفير بسيط من الجزيئات الصغيرة (الشكل 1B). وجدنا أن يسببها نيكوتيناميد القلب ، نسب التزام مباشر من عluripotent hESCs تحت ثقافة المعرفة التي تقدم للضرب مزيد من العضلية ذات كفاءة عالية (الشكل 2). Nkx2.5 هو النسخ المحفوظة homeobox evolutionally عاملا لا غنى عنه لتحقيق التنمية القلب الطبيعي والطفرات في الجينات البشرية المقترنة مع أمراض القلب الخلقية (CHD) ، وأكثرها شيوعا عيب خلقي الإنسان 16. التعبير عن Nkx2.5 هو اقرب علامة للحصول على خلايا القلب السلائف في جميع الفقاريات حتى الآن فحص وضروري لتحوجز القلب السليم وتكوين / نضوج نظام التوصيل الكهربائي 16. في الفقاريات ، وظهور نمط من التعبير Nkx2.5 المبكر تتزامن تقريبا مع توقيت ومجال المواصفات القلب في مرحلة التطور الجنيني المبكر ، وNkx2.5 الجين لا يزال يعبر عنها من خلال التنمية في القلب 16. في نموذج hESC لدينا ، وبدا حركة عدم الانحياز لتحريك القلب تحريض مباشر من hESCs المحفزة من خلال تشجيع التعبير عن القلب محددة transcription Nkx2.5 عاملا في العملية التي قد تحاكي مواصفات cardiomesoderm من الأديم الظاهر في المحفزة تخلق القلب الجنينية البشرية. وسوف تكشف الدراسات المستقبلية مراقبة الجزيئات الجينية وجينية في مجال التنمية البشرية كبدائل القلب ، مما قد يمهد الطريق للسيطرة على جزيء صغير بوساطة مباشرة والتشكيل مصير المحفزة hESC عند اشتقاق الأنساب سريريا ذات الصلة لعلاجات التجدد. حركة عدم الانحياز من دون علاج ، فإن <hESCs 2 ٪ الخضوع التمايز عفوية إلى الضرب العضلية 12-15. مع العلاج حركة عدم الانحياز ، وكنا قادرين على توليد> 95 ٪ السلائف القلب العضلية الجنينية والضرب> 50 ٪ من hESCs حافظت ظل ثقافة تحدد في عملية التنمية البشرية قد تحاكي القلب الجنينية 12. في الآونة الأخيرة ، استخدمت يعرف مصير القلب ، لتحديد الجينات transdifferentiate الليفية الماوس إلى ما بعد الولادة العضلية الضرب مع انخفاض كفاءة 0.5 ٪ <17 ، 18 </ سوب>. ومع ذلك ، فقد تم إعادة برمجة الخلايا تاريخيا الجسدية المرتبطة الشاذ التعبير الجيني وتسارع الشيخوخة مع فائدة علاجية ضعاف 19-21. أخيرا ، تقتصر على البروتوكول وضعناها هنا لhESCs المحفزة المستمدة من الكتلة الخلوية الداخلية (ICM) أو الأديم الظاهر من 4،5 الكيسة الإنسان ، قد لا ينطبق على الخلايا المحفزة الأخرى ، بما فيها المجالس الاقتصادية والاجتماعية ، نشأت المجالس الاقتصادية والاجتماعية الحيوانية المستمدة من morula في وقت سابق (ثماني خلايا) في المرحلة 22 الأجنة والخلايا برمجتها بشكل مصطنع 23.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم دعم XHP بواسطة المعهد الوطني للمنح (NIH) الصحة من المعهد الوطني للشيخوخة (NIHK01AG024496) يونيس كينيدي وشرايفر المعهد القومي لصحة الطفل والتنمية البشرية (NIHR21HD056530).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Matrigel | BD bioscience | 356231 | Growth factor reduced |
Human laminin | Sigma | L6274 | |
Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
DMEM/F12 | Invitrogen | 10565042 | |
DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
MEM amino acids solution (MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
Ascorbic acid | Sigma | A4403 | |
Human transferrin | Sigma | T8158 | |
Human bFGF | PeproTech | AF-100-18B | |
Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
Human activin A | PeproTech | 120-14E | |
Defined FBS | Hyclone | SH30073-03 | |
6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
6-well plate | Corning | 3516 |