Abbiamo stabilito un protocollo per l'induzione della cardioblasts pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di risorse umane progenitori cardiaci e funzionale cardiomiociti per la riparazione cardiovascolare.
Fino ad oggi, la mancanza di una adeguata fonte di cellule cardiache umane è stata la battuta d'arresto importante nella rigenerazione del miocardio umano, sia a base di cellule staminali ematopoietiche o da 1-3 ingegneria dei tessuti cardiaci. Cardiomiociti diventano terminali differenziati subito dopo la nascita e perdono la loro capacità di proliferare. Non ci sono prove che cellule staminali / progenitrici derivate da altre fonti, come il midollo osseo o il sangue del cordone ombelicale sono in grado di dare origine alle cellule contrattili del muscolo cardiaco in seguito al trapianto nel cuore 1-3. La necessità di rigenerare o riparare il muscolo cardiaco danneggiato non è stato raggiunto con la terapia con cellule staminali adulte, sia endogena o tramite la consegna delle cellule 1-3. Le cellule umane geneticamente stabili staminali embrionali (hESC) hanno la capacità di espansione illimitata e plasticità illimitata, porge un serbatoio pluripotenti per la derivazione in vitro di grandi quantità di cellule somatiche umane che sono limitate al lignaggio nel bisognodi riparazione e rigenerazione 4,5. A causa della prevalenza delle malattie cardiovascolari in tutto il mondo e acuta mancanza di organi, c'è un interesse intenso hESC terapie a base di sviluppo come un approccio alternativo. Tuttavia, come incanalare il potenziale ampia differenziazione delle hESC pluripotenti in modo efficiente e prevedibile di un fenotipo desiderato è stato una grande sfida sia per lo studio e la traduzione di sviluppo clinico. Approcci convenzionali si basano su multi-lignaggio inclinazione di cellule pluripotenti attraverso la differenziazione spontanea foglietto embrionale, con conseguente inefficienza e incontrollabile lignaggio impegno che viene spesso seguita da eterogeneità fenotipica e instabilità, di conseguenza, un elevato rischio di cancerogenicità 6-8 (vedere uno schema a fig. 1A). Inoltre, non definito integratori stranieri / animale biologica e / o alimentatori che sono stati generalmente utilizzati per l'isolamento, l'espansione e la differenziazione delle hESC può utilizzarli direttamente di tali cellule specialiinnesti di Zed nei pazienti problematici 9-11. Per superare questi ostacoli, abbiamo risolto gli elementi di un sistema di coltura definito necessaria e sufficiente per sostenere la epiblast pluripotence di hESC, che funge da piattaforma per la derivazione de novo di hESC clinicamente adeguata ed efficace regia hESC quali uniformemente verso lignaggi clinicamente rilevanti da piccole molecole 12 (vedere uno schema in figura. 1B). Dopo lo screening di una serie di piccole molecole e fattori di crescita, abbiamo riscontrato che tali condizioni definite reso nicotinamide (NAM) sufficiente a indurre le specifiche del cardiomesoderm diretto da hESC pluripotenti che ulteriormente progredita al cardioblasts cardiomiociti umani che ha generato battendo ad alta efficienza (fig. 2 ). Abbiamo definito le condizioni per l'induzione di cardioblasts diretto da hESC pluripotenti senza un intervento a più fasi embrionali lignaggio corpo, consentendo ben controllati derivazione efficiente di ungrande disponibilità di cellule cardiache per tutta la gamma di stadi di sviluppo per le terapie basate sulle cellule.
Una delle sfide più importanti sia per lo studio dello sviluppo e la traduzione clinica è stata come incanalare le ampie potenzialità di differenziazione delle cellule staminali umane pluripotenti da un fenotipo desiderato in modo efficiente e prevedibile. Anche se tali cellule possono differenziarsi spontaneamente in vitro in cellule di tutti gli strati germinali passando attraverso un multi-lignaggio fase aggregata, in hESC derivati multi-lignaggio aggregati (corpi embrionali), solo una piccola frazione di cellule (<2%) spontaneamente differenziarsi in cardiomiociti 13-15 (Fig. 1A). Immunoselection seguito, le popolazioni arricchite di cardiomiociti stati in grado di fungere da pacemaker biologico per salvare la funzione di un miocardio danneggiato meccanicamente ed elettronicamente dopo l'iniezione nel cuore di modelli animali 13. In modelli di roditori infartuata, radicato hESC derivati progenie cardiaco sono stati in grado di sopravvivere e maturare fino a 12 settimane, e parzialmente remuscularizzare il cuore ferito e migliorare la funzione contrattile 14,15. Tuttavia, l'inefficienza nella generazione di umani impegnati cellule cardiache attraverso multi-lignaggio differenziazione delle cellule pluripotenti e l'alto rischio di cancerogenicità a seguito di trapianto hanno impedito ulteriori traduzioni cliniche. Sviluppare strategie per incanalare l'ampio potenziale di differenziazione hESC pluripotenti esclusivamente e prevedibile di un fenotipo cardiaco è fondamentale per sfruttare la potenza di biologia hESC in campo cuore. Per raggiungere in modo uniforme la conversione di cellule staminali umane pluripotenti da una stirpe particolare, abbiamo impiegato un sistema di coltura definito in grado di assicurare la proliferazione di hESC indifferenziato per identificare le condizioni per ben controllata induzione efficiente delle hESC pluripotenti esclusivamente ad una particolare stirpe clinicamente rilevanti dalla semplice fornitura di piccole molecole (Fig. 1B). Abbiamo scoperto che nicotinamide indotto cardio-lignaggio impegno diretto da phESC luripotent sotto cultura definita che ulteriormente progredita per battere cardiomiociti ad alta efficienza (Fig. 2). Nkx2.5 è evolutivamente conservata fattore di trascrizione homeobox indispensabile per il normale sviluppo cardiaca e le mutazioni del gene sono associate a malattie cardiache congenite umane (CHD), il difetto più comune nascita umana 16. Espressione di Nkx2.5 è il primo marcatore di cellule precursori cuore in tutti i vertebrati finora esaminato ed è essenziale per una corretta septation cardiaco e la formazione / maturazione del sistema di conduzione elettrico 16. Nei vertebrati, l'inizio e il modello di inizio Nkx2.5 espressione o meno coincidere con i tempi e l'area di specifica cardiache in embriogenesi precoce e Nkx2.5 gene continua ad essere espressa attraverso lo sviluppo nel cuore 16. Nel nostro modello hESC, NAM è apparso per attivare l'induzione cardiaco diretto da hESC pluripotenti, promuovendo l'espressione di cardio-specifica transcriPZIONE Nkx2.5 fattore in un processo che potrebbe emulare le specifiche del cardiomesoderm dal epiblast pluripotenti umane in cardiogenesis embrionale. Studi futuri rivelerà molecole controllo genetico ed epigenetico dello sviluppo cuore umano come alternative, che possono aprire la strada a piccole molecole-mediata controllo diretto e la modulazione del destino hESC quando pluripotenti derivanti lignaggi clinicamente rilevanti per terapie rigenerative. Senza trattamento NAM, hESC <2% sarà oggetto di differenziazione spontanea in cardiomiociti battendo 12-15. Con il trattamento NAM, siamo stati in grado di generare> 95% precursori embrionale cardiomiociti battito cardiaco e> 50% da hESC mantenuto nell'ambito di una definizione di cultura in un processo che potrebbe emulare sviluppo embrionale umano cuore 12. Recentemente, noto cardio-destino geni determinanti sono stati utilizzati per transdifferenziarsi fibroblasti di topo in cardiomiociti battendo post-natale, con una bassa efficienza di <0,5% 17, 18 </ Sup>. Tuttavia, riprogrammato le cellule somatiche sono state storicamente associato con l'espressione genica anormale e senescenza accelerata con compromissione della utilità terapeutica 19-21. Infine, il protocollo abbiamo stabilito qui è limitato alle hESC pluripotenti derivate dalla massa cellulare interna (ICM) o epiblast della blastocisti umana 4,5, possono non applicare alle cellule pluripotenti altri, tra cui origine animale-CES, CES derivato da morula precedente (otto cellule)-stadio embrioni 22, e le cellule riprogrammate artificialmente 23.
The authors have nothing to disclose.
XHP è stato sostenuto dal National Institute of Health (NIH) sovvenzioni da National Institute on Aging (NIHK01AG024496) e The Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health e lo Sviluppo Umano (NIHR21HD056530).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Matrigel | BD bioscience | 356231 | Growth factor reduced |
Human laminin | Sigma | L6274 | |
Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
DMEM/F12 | Invitrogen | 10565042 | |
DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
MEM amino acids solution (MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
Ascorbic acid | Sigma | A4403 | |
Human transferrin | Sigma | T8158 | |
Human bFGF | PeproTech | AF-100-18B | |
Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
Human activin A | PeproTech | 120-14E | |
Defined FBS | Hyclone | SH30073-03 | |
6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
6-well plate | Corning | 3516 |