Nós estabelecemos um protocolo para indução de cardioblasts direta de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas mantidas sob condições definidas com pequenas moléculas, que permite a derivação de uma grande oferta de recursos humanos progenitores cardíaca e funcional cardiovascular cardiomiócitos para reparação.
Até o momento, a falta de uma fonte de células adequado cardíaco humano tem sido o grande revés na regeneração do miocárdio humano, seja por celular baseado em transplante cardíaco ou por engenharia tecidual 1-3. Cardiomiócitos se tornar terminalmente diferenciadas logo após o nascimento e perdem a capacidade de proliferar. Não há evidências de que haste / progenitor células derivadas de outras fontes, tais como a medula óssea ou do sangue do cordão umbilical, são capazes de dar origem a células musculares de contração do coração após o transplante para o coração 1-3. A necessidade de regenerar ou reparar o músculo cardíaco danificado não foi cumprido pela terapia de células-tronco adultas, seja endógena ou através da entrega de célula 1-3. O geneticamente estáveis células estaminais embrionárias humanas (hESCs) têm capacidade de expansão ilimitada e irrestrita plasticidade, proferindo um reservatório pluripotentes no derivação in vitro de grandes quantidades de células somáticas humanas que são restritos à linhagem em necessidadede reparo e regeneração 4,5. Devido à prevalência de doença cardiovascular em todo o mundo e aguda escassez de doadores de órgãos, existe grande interesse em terapias CTEh baseado em desenvolvimento como uma abordagem alternativa. No entanto, como canalizar o potencial de diferenciação gama de hESCs pluripotentes de forma eficiente e previsível para um fenótipo desejado tem sido um grande desafio tanto para estudo de desenvolvimento e tradução clínica. Abordagens convencionais dependem de multi-linhagem inclinação de células pluripotentes através da diferenciação espontânea germe de camada, resultando em ineficiência e incontrolável linhagem compromisso, que é muitas vezes seguido de heterogeneidade fenotípica e instabilidade, portanto, um risco elevado de tumorigenicidade 6-8 (ver um esquema em fig. 1A). Além disso, indefinido estrangeiros / animal suplementos biológicos e / ou alimentadores que tenham sido tipicamente usadas para o isolamento, expansão e diferenciação de hESCs pode fazer uso direto de tais células-specialized enxertos em pacientes problemáticos 9-11. Para superar esses obstáculos, temos resolvido os elementos de um sistema de cultura definidas necessárias e suficientes para sustentar o epiblasto pluripotence de hESCs, servindo como uma plataforma para a derivação de novo de hESCs clinicamente adequado e eficaz direcionando hESCs tais uniformemente para linhagens clinicamente relevante por pequenas moléculas 12 (ver um diagrama esquemático na fig. 1B). Após a triagem de uma variedade de pequenas moléculas e fatores de crescimento, verificou-se que tais condições definidas prestados nicotinamida (NAM) suficiente para induzir a especificação de cardiomesoderm direta de hESCs pluripotentes que mais progrediu para cardioblasts que gerou humana cardiomiócitos batendo com alta eficiência (Fig. 2 ). Nós definimos as condições para a indução de cardioblasts direta de hESCs pluripotentes sem uma intervenção multi-estágio corpo linhagem embrióides, permitindo bem controlados derivação eficiente de umgrande oferta de células cardíacas humanas em todo o espectro de estágios de desenvolvimento para a célula-base terapêutica.
Um dos grandes desafios tanto para estudos de desenvolvimento e tradução clínica tem sido a forma de canalizar o potencial de diferenciação gama de células-tronco pluripotentes humanas a um fenótipo desejado de forma eficiente e previsível. Apesar de tais células podem se diferenciar espontaneamente in vitro em células de todas as camadas germinativas, passando por uma fase agregado multi-linhagem, em CTEh derivados multi-linhagem agregados (corpos embrióides), apenas uma fração muito pequena de células (<2%) espontaneamente diferenciar em cardiomiócitos 13-15 (Fig. 1A). Immunoselection seguintes, a população enriquecida de cardiomiócitos foram capazes de funcionar como marca-passos biológicos para resgatar a função de um miocárdio danificado mecanicamente e eletronicamente após a injeção no coração de modelos animais 13. Em modelos de roedores infartada, enxertada CTEh progênies derivadas cardíacos foram capazes de sobreviver e amadurecer até 12 semanas, e parcialmente remuscularize o coração ferido e melhorar a função contrátil 14,15. No entanto, a ineficiência na geração cardíaco humano comprometido células através de multi-linhagem diferenciação de células pluripotentes e alto risco de transplante tumorigenicidade seguintes têm impedido de nova tradução clínica. Desenvolvimento de estratégias para canalizar o potencial de diferenciação gama de hESCs pluripotentes exclusiva e previsivelmente a um fenótipo cardíaco é vital para aproveitar o poder da biologia CTEh no campo do coração. A fim de alcançar uniformemente conversão de células pluripotentes estaminais humanas a uma linhagem especial, empregamos um sistema de cultura definido capaz de segurar a proliferação de hESCs indiferenciado para identificar as condições para o bem-controlados de indução eficiente de hESCs pluripotentes exclusivamente para uma determinada linhagem clinicamente relevante pelo simples fornecimento de pequenas moléculas (Fig. 1B). Descobrimos que a nicotinamida induzida comprometimento cardíaco de linhagem direta de phESCs luripotent sob cultura definido que mais progrediu para bater cardiomiócitos com alta eficiência (Fig. 2). Nkx2.5 é um fator de transcrição evolutivamente conservada homeobox indispensável para o desenvolvimento cardíaca normal e mutações do gene são associadas à doença cardíaca humana congênitas (CC), o defeito de nascimento mais comuns humana 16. Expressão de Nkx2.5 é o primeiro marcador de células precursoras de coração em todos os vertebrados, até agora examinado e é essencial para a septação cardíaca adequada e formação / amadurecimento do sistema de condução elétrica 16. Nos vertebrados, o início eo padrão de expressão Nkx2.5 início cerca de coincidir com o calendário e área de especificação na embriogênese cardíaca precoce, e Nkx2.5 gene continua a ser expressa através do desenvolvimento no coração 16. Em nosso modelo CTEh, NAM apareceu para acionar a indução direta de hESCs cardíaca pluripotentes através da promoção da expressão de cardíacas específicas transcriNkx2.5 PÇÃO fator em um processo que pode emular a especificação de cardiomesoderm do epiblasto pluripotentes em cardiogenesis embrionárias humanas. Futuros estudos revelarão moléculas controle genéticas e epigenéticas no desenvolvimento coração humano como alternativas, que podem pavimentar o caminho para o controle de molécula pequena mediada direta e modulação do destino pluripotentes CTEh quando derivar linhagens clinicamente relevantes para terapias regenerativas. Sem tratamento NAM, <hESCs 2% passarão por diferenciação espontânea em bater cardiomiócitos 12-15. Com o tratamento NAM, temos sido capazes de gerar> 95% embrionárias precursores cardíacos e cardiomiócitos batendo> 50% de hESCs mantido sob uma cultura define em um processo que pode emular o desenvolvimento embrionário do coração humano 12. Recentemente, conhecido destino cardíacas genes determinantes têm sido usados para transdifferentiate fibroblastos de rato em pós-natal cardiomiócitos batendo com uma baixa eficiência de <0,5% 17, 18 </ Sup>. No entanto, as células somáticas reprogramadas têm sido historicamente associada com a expressão do gene anormal e senescência acelerada com utilidade terapêutica prejudicada 19-21. Finalmente, o protocolo que estabelecemos aqui é limitado a hESCs pluripotentes derivadas da massa celular interna (ICM) ou epiblasto do blastocisto humano 4,5, pode não se aplicar a outras células pluripotentes, incluindo animais originou-CES, CES derivado de mórula anterior (oito células) em estágio embriões 22, e as células reprogramadas artificialmente 23.
The authors have nothing to disclose.
XHP foi apoiado pelo National Institute of Health (NIH) doações do National Institute on Aging (NIHK01AG024496) e A Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health e Desenvolvimento Humano (NIHR21HD056530).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
---|---|---|---|
Gelatin | Sigma | G1890 | |
Matrigel | BD bioscience | 356231 | Growth factor reduced |
Human laminin | Sigma | L6274 | |
Nicotinamide | Sigma | N0636 | |
DMEM/F12 | Invitrogen | 10565042 | |
DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
MEM amino acids solution (MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
β-Mercaptoethanol | Invitrogen | 21985023 | |
Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
Ascorbic acid | Sigma | A4403 | |
Human transferrin | Sigma | T8158 | |
Human bFGF | PeproTech | AF-100-18B | |
Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
Human activin A | PeproTech | 120-14E | |
Defined FBS | Hyclone | SH30073-03 | |
6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
6-well plate | Corning | 3516 |