本文详细解剖程序,工具设置,并在光学测绘跨膜电位(VM)和细胞内钙瞬变(CAT),在隔离的Langendorff完整的实验条件下灌注小鼠心脏。
鼠标心脏是一个流行的模式由于成本低,在这个物种的基因工程技术存在心血管研究。心血管鼠标心脏生理表型可以很容易地使用荧光成像技术,采用各种探头跨膜电位(V M),钙瞬变(CAT),以及其他参数。兴奋收缩偶联的特点是动作电位和细胞内钙离子的动态,因此,它是极其重要的映射 V M和CAT同时从同一位置上的心脏 1-4 。同时,从光映射的Langendorff灌注小鼠心脏有可能澄清心脏衰竭,心律失常,代谢性疾病,和其他心脏疾病的基本机制。可视化激活,传导速度减慢,动作电位时程,并在无数的网站的其他参数可以不实现从细胞水平调查, 但光学映射1,5,6解决。在本文中,我们目前的仪表安装和实验条件的同步光映射在小鼠心脏V M和CAT高时空决议,利用国家的最先进的CMOS成像技术。用这种方法得到一致的光录音说明的Langendorff灌注小鼠心脏,同时光的映射是可行和可靠的。
在这个实验中,我们修改了加入一个小的硅管,这是特别重要的室性早搏抑制与兴奋收缩解偶联剂后Langendorff灌流方法。硅管是用来防止解充血,灌注液酸化,并在左心室缺血的发展。鼠标心脏是,以低温非常敏感,因此,整个心脏的温度变化会导致动作电位持续时间的人为差异。因此,灌注室加热系统实施,以保持一个温度恒定在37 ° C,在整个实验的 8 。的Langendorff模型由于不保留神经支配的心脏,需要考虑增加神经递质的灌流,以探讨生理和副交感神经的语气 9 。除了逆行灌注,灌流的心脏除了有助于保持适宜的环境参数,如pH值和温度。在此方法中的Langendorff灌流心脏水平放置。一个垂直Langendorff灌流设置,也可以用 10,但可能会导致在略有不同心脏力学11。除了CMOS摄像头,其他探测器也可,并可以应用到地图 V M和CAT 同时 12 。
高时空分辨率的CMOS摄像头的应用,保证了录音的准确性,但是,光的映射信号不是从一个单细胞。相反,每个荧光信号来自数百或数千个细胞,视光学倍率。心室荧光大得多,可以扭曲心房光散射信号;因此,细致的解释是需要的光学记录的信号。鼠标准备的另一个限制是由表面的曲率,由于体积小的心脏13引起的信号失真和噪声。不仅从鼠标心脏的曲率,但也可以从电极的极性和虚拟电极传导速度的测量,可以改变。为了实现传导速度,激活各向异性,和复极地图的准确性,正确的相机的聚焦在心脏表面是必不可少的。
在此方法中,实时心电图记录可以补充的心脏电生理光学调查。电压敏感染料(RH237)和钙(Rhod – 2AM)使用的协议,因为他们的反应速度快,类似的激励,和不同的发射光谱3,7。有替代染料,可用于测量V M和CAT比RH237和Rhod – 2AM 3组合。一种新型电压敏感染料,PGHI斯托克的一个大转变(> 200nm的),被发现,以便更好的 V M和猫,因为更大的分离PGHI和Rhod上午02时14之间的发射波长信号。今后的改进重点放在探索新型的荧光探针,开发新的成像探测器,和改进的图像处理软件。较高的分辨率和光学成像方式,新型三维光映射也是重要的未来发展方向的光的映射5。
The authors have nothing to disclose.
国立卫生研究院拨款R01 HL085369。
Chemical | Company | Catalog Number |
NaCl | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S271-1 |
CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | C79-500 |
KCl | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S217-500 |
MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | M33-500 |
NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S369-500 |
NaHCO3 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S233-3 |
D-Glucose | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | D16-1 |
Blebbistatin | Tocris Bioscience, Ellisville, MO | 1760 |
RH237 | Invitrogen, Carlsbad, CA | S1109 |
Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | R1244 |
Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA | P3000MP |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma, St. Louis, MO | D2650 |
Material | Company | Catalog Number |
PowerLab 26T | AD Instruments, Sydney, Australia |