Detta dokument beskrivs de dissektion förfarande, instrumentell inställning, och experimentella förhållanden under optiska kartläggningen av transmembrana potential (VM) och intracellulär kalcium övergående (CAT) i intakta isolerade Langendorff perfusion musen hjärtan.
Musen Hjärtat är en populär modell för hjärt-studierna på grund av förekomsten av låg kostnad teknik för genteknik i denna art. Hjärt fysiologiska fenotypning av musen hjärtat kan enkelt göras med hjälp av fluorescens avbildning anställa olika prober för transmembrana potential (V m), kalcium transienter (CAT) och andra parametrar. Excitation-kontraktion koppling kännetecknas av aktionspotentialen och intracellulär kalcium dynamik, och därför är det oerhört viktigt att kartlägga både V m och katt samtidigt från samma plats på hjärtat 1-4. Samtidig optiska kartläggning från Langendorff perfusion musen hjärtan har potential att klarlägga mekanismerna bakom hjärtsvikt, arytmier, metaboliska sjukdomar, och andra hjärtsjukdomar. Visualisering av aktivering, kan överledning hastighet, durationen av aktionspotentialen, och andra parametrar i en myriad av platser inte uppnås från cellnivå undersökningen men är väl lösas genom optisk kartläggning 1,5,6. I detta paper presenterar vi instrumentering installation och experimentella förhållanden för samtidig optiska kartläggning av V m och katt i mus hjärtan med hög tid och rum upplösning med hjälp av state-of-the-art CMOS-teknik. Konsekvent optiska inspelningar erhålls med denna metod visar att samtidig optiska kartläggning av Langendorff perfusion mus hjärtan är både möjlig och tillförlitlig.
I detta experiment har vi ändrat Langendorff perfusionen metoden genom att lägga till ett litet silikon slang, vilket är särskilt viktigt efter undertryckandet av ventrikulära kontraktioner med en excitation-kontraktion uncoupler. Kisel röret används för att förhindra lösning trängsel, försurning av perfusion lösningen, och utveckling av ischemi i vänster kammare. Musen Hjärtat är mycket känsligt för hypotermi, och därför kommer temperaturvariationer över hjärtat orsaken artificiella skillnader i löptider aktionspotential. Följaktligen var ett värmesystem genomförs i perfusionen kammaren för att hålla en konstant temperatur på 37 ° C under hela det experiment 8. Eftersom en Langendorff modellen inte behåller innervation av hjärta, måste man överväga att lägga signalsubstanser till perfusatet för att undersöka fysiologiska sympatiska och parasympatiska tonen 9. Förutom retrograd perfusion, hjälper tillägg av superfusion hos hjärtat att upprätthålla lämpliga miljöparametrar som pH och temperatur. I denna metod var Langendorff perfusion hjärtat horisontellt placerad. En vertikal Langendorff perfusion inställning kan också användas för 10, men kan resultera i något olika hjärt mekanik 11. Förutom CMOS-kameror, alternativt detektorer är också tillgängliga och kan användas för att kartlägga V m och CAT samtidigt 12.
Tillämpning av CMOS-kameror av hög tid och rum upplösning säkerställer riktigheten i inspelningarna, men optiska kartläggning signaler är inte från en enda cell. Istället kommer varje fluorescerande signal från hundratals eller tusentals celler, beroende på optisk förstoring. Den betydligt större ventrikulära fluorescens kan snedvrida förmaksflimmer signaler genom optiska spridning, och därför är försiktig tolkning av optiskt inspelade signaler som krävs. En annan begränsning av musen preparatet är signalen distorsion och brus som orsakas av krökning av ytan på grund av den begränsade storleken på hjärtat 13. Conduction hastighet mätningar kan ändras inte bara från krökning av musen hjärta men också från elektroden polaritet och virtuella elektroder. För att uppnå noggrannhet för ledning hastighet, aktivering anisotropi och kartor repolarisering, korrekt fokusering av kameran på ytan av hjärtat är viktigt.
I denna metod kan i realtid EKG-registreringar komplettera optiska undersökning av hjärtats elektrofysiologi. Spänningskänsliga färgämne (RH237) och kalcium indikator (Rhod-2:00) används i protokollet på grund av deras snabba svar, liknande excitation, och distinkta emissionsspektra 3,7. Det finns alternativa kombinationer av färger som kan användas för att mäta V m och CAT än RH237 och Rhod-2:00 3. En roman spänningskänsliga färg, PGHI, med en stor Stoke arbetspass (> 200 sjömil) konstaterades att möjliggöra en bättre V m och signaler CAT på grund av ökad separation av utsläpp våglängder mellan PGHI och Rhod-2:00 14. Framtida förbättringar kan fokusera på att utforska nya fluorescerande prober, utveckling av nya avbildning detektorer, och förbättrade bildbehandlingsprogram. Högre upplösning och nya optiska metoder bildhantering för 3D optisk kartläggning är också viktiga framtida inriktningar av optiska kartläggning 5.
The authors have nothing to disclose.
NIH bidrag R01 HL085369.
Chemical | Company | Catalog Number |
NaCl | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S271-1 |
CaCl2 (2H2O) | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | C79-500 |
KCl | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S217-500 |
MgCl2 (6H2O) | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | M33-500 |
NaH2PO4 (H2O) | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S369-500 |
NaHCO3 | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | S233-3 |
D-Glucose | Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ | D16-1 |
Blebbistatin | Tocris Bioscience, Ellisville, MO | 1760 |
RH237 | Invitrogen, Carlsbad, CA | S1109 |
Rhod-2AM | Invitrogen, Carlsbad, CA | R1244 |
Pluronic F127 | Invitrogen, Carlsbad, CA | P3000MP |
Dimethyl sulphoxide (DMSO) | Sigma, St. Louis, MO | D2650 |
Material | Company | Catalog Number |
PowerLab 26T | AD Instruments, Sydney, Australia |