冰帽的方法使一个成长中的96孔板,每个幼苗根组织非破坏性的收获的植物。从这个根组织中提取的DNA可用于基因分型反应。我们已经发现,冰帽可以很好地用于<em>拟南芥</em>,番茄,水稻秧苗。
它正在成为植物科学家的共同开发项目,需要大量的植物基因分型。在任何基因分型项目的第一步是从每个工厂收集组织样本。这项任务的传统方法是一个在每次一个样本植物。如果一个基因型数百或数千人的愿望,但是,使用基因分型管道中的一个重大的瓶颈这一战略的结果。冰帽,我们在这里描述的方法,高通量的解决方案,允许一个科学家收集从几千元苗在一个单一的一天1,2组织提供了这一挑战。这种级别的吞吐量是可能的,组织是从植物中收获,而不是一个- A – 96 – AT – A -,。
冰帽方法提供了一个集成平台,进行幼苗生长,组织收获,和DNA的提取。冰帽的基础是seedli增长农工商在堆放的96孔板对。上盘井含有琼脂生长介质上的个别幼苗发芽的插头。根向下生长通过琼脂培养基中,通过一个洞退出的上盘,并传递到一个较低的板块含有水。收获组织DNA的提取,在较低的板根组织水是迅速冻结,而在上盘的秧苗保持在室温。离下盘上盘,然后去皮,产生一盘96根组织冷冻样品在冰和一盘96个可行的幼苗。这项技术被命名为“冰帽”,因为它使用冰捕捉到根组织。 96孔板中,含有幼苗,然后包裹在铝箔和转移到低温。此过程中挂起的幼苗进一步增长,但并不影响他们的生存能力。一旦基因型分析已经完成,所需的基因型的幼苗可以转移到96孔p后期进一步传播的土壤。我们已经展示了使用拟南芥 ,番茄,水稻秧苗的冰帽方法的效用。我们预计,该方法也应该适用于其他物种的植物种子小到足以放入96孔板井。
这里介绍的方法,使冰帽一位科学家从数以百计,甚至数以千计的个别工厂,在某一天收集组织样本,并有效地从这些样本中提取基因组DNA用于基因分型反应。冰帽方法给予科学家个人的能力基因型数以千计的幼苗,在很短的时间内,有潜力,以促进遗传实验,否则不会实际执行数。下面提供了几个例子。
背后iTILLING的想法是产生一个短暂的突变体的人口,这在传统的园艺项目创造了持久的突变人口站。 iTILLING,膨体M2的人口从种子播种到50至100冰帽块,并使用冰帽法提取DNA是,拟南芥幼苗,然后放置在4 ° C,而使用冰帽的DNA进行突变筛查PREPS。番茄幼苗被储存在12 ° C。一旦苗木携带所需的突变已经确定,他们是冰帽板回收,并转移到土壤中。 iTILLING是不打算提供一个长期持久的整个研究界的突变人口屏幕。相反,iTILLING提供了一个策略,其中一个科学家可以通过屏幕一个自定义的突变人口极少数的基因突变快速,高效,并在相对较低的成本。
我们发现冰帽是一个有效的方法,种植和基因分型的拟南芥,番茄,和水稻。我们预计,其他植物物种也应服从冰帽。冰帽,可容纳的各种物种的一个限制是种子的大小。只有植物种子小到足以放入一个96孔板井将在其目前的配置冰帽兼容。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由来自国家科学基金会(批准号MCB – 0447750)的资助。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
GenoGrinder | Spex/CertiPrep, Metuchen, NJ | 2000 Geno/Grinder | Machine for shaking Root Plates for DNA extraction |
ABgene Thermo-Sealer | ABgene USA | AB-0384 | Manual heat sealing machine used to Root Plates prior to tissue disruption |
Centrifuge equipped with swinging microplate carriers | Beckman Coulter | Allegra 25R | Any centrifuge with swinging microplate carriers would be suitable |
MicroFill Microplate Dispenser | BioTek www.biotek.com |
AF1000A | Automated liquid dispenser for filling microplates |
Bialetti brand 17×11 inch Commercial Large Cookie Sheet | Target Department Store | www.bialetti.com | This specific cookie sheet has the ideal depth for Ice-Cap |
Custom Made Metal Rack | Hardware Store | See text for full description | |
33 Liter plastic storage box | Target Department Store | Sterilite Brand | For Ice-Cap Fountain. Plastic storage box large enough to hold the 17×11 inch cookie sheet |
30 gallon per hour Fountain Pump | Sunterra | 104506 | Small submersible fountain pump available at garden supply stores |
Hose for fountain pump | Any lab supply company | Hose compatible with fountain pump | |
Plastic Clamp | Hardware Store | Clamp to hold hose to cookie sheet | |
Clear plastic lids from Falcon Microtest flat bottom 96-well polystyrene plates | BD Falcon www.bdbiosciences.com |
351172 | Clear plastic lids for covering Ice-Cap Seedling Plates |
3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
3/32-inch diameter stainless steel balls | Hartford Technologies, Rocky Hill, CT | 034-006-1K | Used to disrupt root tissue after harvest |
3 inch Elastic hair bands | Local grocery store | Used to secure Root Plate to Seedling Plate | |
4 mm diameter wooden skewers | Local grocery store | These skewers are typically used to prepare kabobs | |
Fisher Scientific Nunc brand, 1-mL filter plates without frit | Fisher Scientific | 278012 | 96-well Seedling Plates with holes in bottom. |
Fisherbrand 96-Well Tall-Chimney PCR Plate | Fisher Scientific | 14-230-242 | 96-well Root Plates |
Agar – cell culture tested | Sigma-Aldrich | A1296 | |
4-Morpholinoethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M2933 | |
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture | Sigma-Aldrich | M-5524 | |
Easy Peel heat sealing foil | ABgene USA | AB-0745 | Heat sealing film for sealing Root Plates prior to tissue disruption |
Duck Brand Extra Wide Packaging Tape, 3.00″ x 54.6 yd | OfficeMax www.officemax.com |
Item no. 21242139 | Adhesive tape for sealing microplates containing DNA extracts for storage |
Sealing Roller | Bio-Rad | MSR-0001 | Hand held rolling tool for pressing adhesive sealing tape onto microplates |
96-well metal thermal block | Cole-Parmer | 36400-66 | Used to freeze the Root Plates for tissue harvest |
Whatman Filter paper | Whatman International | 1002 090 | Used for surface sterilizing seeds |
Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | 5 ¾”disposable Pasteur pipette used for transferring seeds to Seedling Plate |
Pyrex baking dish (20 cm x 30 cm) | Target Department Store | Used to construct a dry ice/ethanol bath. |