アイスキャップの方法は1つがそれぞれの苗から96ウェルプレートおよび非破壊的収穫根の組織で植物を育てることができます。このルートの組織から抽出したDNAは、遺伝子型の反応に使用することができます。我々は、アイスキャップがうまく機能することを発見した<em>シロイヌナズナ</em>、トマト、そして稲の苗。
それは植物の多数の遺伝子型を必要とするプロジェクトを開発するための植物科学者のために一般的になりつつある。あらゆるジェノタイピングプロジェクトの最初のステップは、個々の植物から組織サンプルを収集することです。このタスクの伝統的なアプローチは、一度に1台ずつの植物をサンプリングすることです。個人の遺伝子型の数百または数千に1つの願いは、しかし、タイピングパイプラインの重要なボトルネックで、この戦略の結果を使用している場合。ここでは説明しているアイスキャップ法は、ある科学者が一日の1,2で数千本の苗木から組織を収集できるようにすることで、この課題へのハイスループットなソリューションを提供します。スループットのこのレベルは、組織はむしろ、一度に1台ずつではなく、96枚ごとの植物から収穫されているという事実によって実現されています。
アイスキャップ方式では、苗の成長、組織の収穫、およびDNAの抽出を行うための統合プラットフォームを提供します。アイスキャップのための基礎はseedliの成長です。96ウェルプレートの積層ペアのNGS。アッパープレートのウェルは、個々の苗が発芽する寒天の増殖培地のプラグが含まれています。ルーツは、寒天培地を下に成長する穴に通し、上部プレートを終了し、水を含む下側プレートに渡します。アッパープレートの苗は、室温でままDNA抽出のために組織を回収するために、ルートの組織を含む下側プレート内の水が急速に凍結されています。アッパープレートを氷と96実行可能な苗とワンプレートで凍結96ルートの組織サンプルを一つのプレートをもたらして、離れて下側プレートから剥離される。それがルートの組織をキャプチャするために氷を使用するための手法は、"アイスキャップ"という名前です。苗を含む96ウェルプレートは、ホイルで包み、低温に転送できます。このプロセスは、苗のさらなる成長を中断しますが、彼らの生存率には影響しません。遺伝子型の解析が完了したら、目的の遺伝子型を持つ苗木を96ウェルpから転送することができますさらなる伝播のための土壌に遅れて。我々はシロイヌナズナ 、トマト、そして米の苗を使ってアイスキャップ方式の有用性を実証している。我々は、メソッドはまた、96ウェルプレートのウェルに収まるほどの小さな種子を持つ植物の他の種にも適用する必要があることを期待しています。
ここで紹介するアイスキャップ法は一日で、個々の植物の数百、または数千、から組織サンプルを収集し、効率的にタイピング反応で使用するために、これらのサンプルからゲノムDNAを抽出するためにある科学者が可能になります。個々の科学者を短期間で苗木の遺伝子型の数千に能力を与えることによって、アイスキャップ方式では、そうでない場合は実行するために実用的ではないと遺伝学的実験の数を容易にする可能性を秘めています。いくつかの例を以下に用意されています。
iTILLINGの背後にある考え方は、伝統的な耕作のプロジェクト用に作成された耐久性のある変異体の集団とは対照的に立っている一時的な変異個体を、生成することです。 iTILLINGの場合は、筋肉隆々 M2集団から種子は、50から100アイスキャップのブロックに播種し、そしてDNAはアイスキャップ法を用いて抽出されます。 シロイヌナズナ実生は、4に配置されている° C変異のスクリーニングは、アイスキャップのDNAを使用して実行している間プレップ。トマトの苗を12℃で保存されます。苗運搬所望の変異が特定されたら、彼らはアイスキャッププレートから回収し、土壌に転送されます。 iTILLINGは、画面全体の研究コミュニティのための長期的な変異体集団を提供することを意図されていません。その代わり、iTILLINGはどのによって戦略を提供します。ある科学者は、効率的、かつ比較的低コストで、迅速に遺伝子の一握りの突然変異のためのカスタム変異個体を選別できます。
我々はシロイヌナズナ 、トマト、そして米を栽培し、ジェノタイピングのための効果的な方法であることがアイスキャップを発見した。我々は、植物の他の種がまたアイスキャップに従順であることを期待しています。アイスキャップに収容することができる、様々な種の1つの制限は、種子の大きさです。 96ウェルプレートのウェルに収まるほどの小さな種子を持つ唯一の植物は、その現在の構成でアイスキャップと互換性があります。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、国立科学財団(助成番号MCB – 0447750)からの助成金によって賄われていた。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
GenoGrinder | Spex/CertiPrep, Metuchen, NJ | 2000 Geno/Grinder | Machine for shaking Root Plates for DNA extraction |
ABgene Thermo-Sealer | ABgene USA | AB-0384 | Manual heat sealing machine used to Root Plates prior to tissue disruption |
Centrifuge equipped with swinging microplate carriers | Beckman Coulter | Allegra 25R | Any centrifuge with swinging microplate carriers would be suitable |
MicroFill Microplate Dispenser | BioTek www.biotek.com |
AF1000A | Automated liquid dispenser for filling microplates |
Bialetti brand 17×11 inch Commercial Large Cookie Sheet | Target Department Store | www.bialetti.com | This specific cookie sheet has the ideal depth for Ice-Cap |
Custom Made Metal Rack | Hardware Store | See text for full description | |
33 Liter plastic storage box | Target Department Store | Sterilite Brand | For Ice-Cap Fountain. Plastic storage box large enough to hold the 17×11 inch cookie sheet |
30 gallon per hour Fountain Pump | Sunterra | 104506 | Small submersible fountain pump available at garden supply stores |
Hose for fountain pump | Any lab supply company | Hose compatible with fountain pump | |
Plastic Clamp | Hardware Store | Clamp to hold hose to cookie sheet | |
Clear plastic lids from Falcon Microtest flat bottom 96-well polystyrene plates | BD Falcon www.bdbiosciences.com |
351172 | Clear plastic lids for covering Ice-Cap Seedling Plates |
3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
3/32-inch diameter stainless steel balls | Hartford Technologies, Rocky Hill, CT | 034-006-1K | Used to disrupt root tissue after harvest |
3 inch Elastic hair bands | Local grocery store | Used to secure Root Plate to Seedling Plate | |
4 mm diameter wooden skewers | Local grocery store | These skewers are typically used to prepare kabobs | |
Fisher Scientific Nunc brand, 1-mL filter plates without frit | Fisher Scientific | 278012 | 96-well Seedling Plates with holes in bottom. |
Fisherbrand 96-Well Tall-Chimney PCR Plate | Fisher Scientific | 14-230-242 | 96-well Root Plates |
Agar – cell culture tested | Sigma-Aldrich | A1296 | |
4-Morpholinoethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M2933 | |
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture | Sigma-Aldrich | M-5524 | |
Easy Peel heat sealing foil | ABgene USA | AB-0745 | Heat sealing film for sealing Root Plates prior to tissue disruption |
Duck Brand Extra Wide Packaging Tape, 3.00″ x 54.6 yd | OfficeMax www.officemax.com |
Item no. 21242139 | Adhesive tape for sealing microplates containing DNA extracts for storage |
Sealing Roller | Bio-Rad | MSR-0001 | Hand held rolling tool for pressing adhesive sealing tape onto microplates |
96-well metal thermal block | Cole-Parmer | 36400-66 | Used to freeze the Root Plates for tissue harvest |
Whatman Filter paper | Whatman International | 1002 090 | Used for surface sterilizing seeds |
Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | 5 ¾”disposable Pasteur pipette used for transferring seeds to Seedling Plate |
Pyrex baking dish (20 cm x 30 cm) | Target Department Store | Used to construct a dry ice/ethanol bath. |