The Ice-Cap-metoden gjør det mulig å dyrke planter i 96-brønn plater og non-destruktivt høster rot vev fra hver frøplante. DNA ekstrahert fra denne roten vev kan brukes for genotyping reaksjoner. Vi har funnet ut at Ice-Cap fungerer godt for<em> Arabidopsis thaliana</em>, Tomat og ris frøplanter.
Det er blitt vanlig for plante forskere å utvikle prosjekter som krever genotyping av et stort antall planter. Det første trinnet i enhver genotyping prosjektet er å samle en vevsprøve fra hver enkelt plante. Den tradisjonelle tilnærmingen til denne oppgaven er å prøve planter one-på-en-gang. Dersom man ønsker å genotype hundrevis eller tusenvis av individer, men bruker denne strategien resulterer i en betydelig flaskehals i genotyping rørledningen. The Ice-Cap metode som vi beskriver her gir en high-throughput løsning på denne utfordringen ved å la en forsker å samle vev fra flere tusen frøplanter på en enkelt dag 1,2. Dette nivået av gjennomstrømning er gjort mulig ved at vevet er høstet fra planter 96-på-en-gang, snarere enn en-at-a-time.
The Ice-Cap metoden gir en integrert plattform for å utføre frøplante vekst, vev høst, og DNA-ekstraksjon. Grunnlaget for Ice-Cap er fremveksten av seedliNGS i en stablet par 96-brønn plater. Brønnene i øvre plate inneholder plugger av agar vekstmedier som individuelle frøplanter spire. Røttene vokser ned gjennom agar media, avslutter den øvre platen gjennom et hull, og gå over i en lavere plate som inneholder vann. Å høste vev for DNA utvinning, vannet i den nedre plate som inneholder roten vev er raskt frosset mens frøplantene i den øvre platen oppbevares ved romtemperatur. Den øverste platen er da skrellet vekk fra nedre plate, gir en plate med 96 roten vevsprøver frosset i is og en plate med 96 levedyktige frøplanter. Teknikken heter "Ice-Cap" fordi den bruker isen for å fange opp roten vev. 96-brønn plate inneholder frøplantene kan deretter pakket i folie og overført til lav temperatur. Denne prosessen suspenderer videre vekst av frøplantene, men påvirker ikke deres levedyktighet. Når genotype analyser har blitt fullført, kan frøplanter med ønsket genotype bli overført fra 96-brønn Psent til jord for videre forplantning. Vi har vist nytten av Ice-Cap metode å bruke Arabidopsis thaliana, tomat og ris frøplanter. Vi forventer at metoden også bør gjelde for andre arter av planter med frø liten nok til å passe inn i brønnene av 96-brønn plater.
The Ice-Cap metoden presenteres her gjør en forsker å samle inn vevsprøver fra hundrevis eller kanskje tusenvis, av individuelle planter i en enkelt dag og effektivt ekstrakt genomisk DNA fra disse prøvene for bruk i genotyping reaksjoner. Ved å gi den enkelte forsker muligheten til å genotype tusenvis av frøplanter i løpet av kort tid har Ice-Cap metoden potensial til å rette en rekke genetiske eksperimenter som ellers ikke ville være praktisk å utføre. Flere eksempler er gitt nedenfor.
Ideen bak iTILLING er å produsere et flyktig mutant befolkning, som står i kontrast til den holdbar mutant populasjonene opprettet for tradisjonelle Tilling prosjekter. For iTILLING, er frø fra en bulked M2 befolkning sådd inn 50-100 Ice Cap blokker, og DNA er ekstrahert bruker Ice-Cap-metoden. Arabidopsis frøplanter er da plassert ved 4 ° C mens mutasjon screening utføres ved hjelp av Ice-Cap DNA forbereder. Tomato seedlings er lagret ved 12 ° C.. Når seedlings bærer ønsket mutasjoner har blitt identifisert, er de utvinnes fra Ice-Cap plater og overført til jord. iTILLING er ikke ment å gi en langvarig mutant befolkningen for et helt forskningsmiljø til skjerm. I stedet gir iTILLING en strategi deren vitenskapsmann kan sile en tilpasset mutant befolkning for mutasjoner i en håndfull gener raskt, effektivt og til en relativt lav kostnad.
Vi har funnet Ice-Cap å være en effektiv metode for dyrking og genotyping Arabidopsis, tomat, og ris. Vi forventer at andre arter av planter bør også være mottakelig for Ice-Cap. En begrensning på det mangfoldet av arter som kan innpasses ved Ice-Cap er størrelsen på frø. Kun planter med frø liten nok til å passe inn i brønnene på en 96-brønns plate vil være kompatibel med Ice-Cap i sin nåværende konfigurasjon.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble finansiert av et stipend fra National Science Foundation (Grant nummer MCB-0447750).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
GenoGrinder | Spex/CertiPrep, Metuchen, NJ | 2000 Geno/Grinder | Machine for shaking Root Plates for DNA extraction |
ABgene Thermo-Sealer | ABgene USA | AB-0384 | Manual heat sealing machine used to Root Plates prior to tissue disruption |
Centrifuge equipped with swinging microplate carriers | Beckman Coulter | Allegra 25R | Any centrifuge with swinging microplate carriers would be suitable |
MicroFill Microplate Dispenser | BioTek www.biotek.com |
AF1000A | Automated liquid dispenser for filling microplates |
Bialetti brand 17×11 inch Commercial Large Cookie Sheet | Target Department Store | www.bialetti.com | This specific cookie sheet has the ideal depth for Ice-Cap |
Custom Made Metal Rack | Hardware Store | See text for full description | |
33 Liter plastic storage box | Target Department Store | Sterilite Brand | For Ice-Cap Fountain. Plastic storage box large enough to hold the 17×11 inch cookie sheet |
30 gallon per hour Fountain Pump | Sunterra | 104506 | Small submersible fountain pump available at garden supply stores |
Hose for fountain pump | Any lab supply company | Hose compatible with fountain pump | |
Plastic Clamp | Hardware Store | Clamp to hold hose to cookie sheet | |
Clear plastic lids from Falcon Microtest flat bottom 96-well polystyrene plates | BD Falcon www.bdbiosciences.com |
351172 | Clear plastic lids for covering Ice-Cap Seedling Plates |
3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
3/32-inch diameter stainless steel balls | Hartford Technologies, Rocky Hill, CT | 034-006-1K | Used to disrupt root tissue after harvest |
3 inch Elastic hair bands | Local grocery store | Used to secure Root Plate to Seedling Plate | |
4 mm diameter wooden skewers | Local grocery store | These skewers are typically used to prepare kabobs | |
Fisher Scientific Nunc brand, 1-mL filter plates without frit | Fisher Scientific | 278012 | 96-well Seedling Plates with holes in bottom. |
Fisherbrand 96-Well Tall-Chimney PCR Plate | Fisher Scientific | 14-230-242 | 96-well Root Plates |
Agar – cell culture tested | Sigma-Aldrich | A1296 | |
4-Morpholinoethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M2933 | |
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture | Sigma-Aldrich | M-5524 | |
Easy Peel heat sealing foil | ABgene USA | AB-0745 | Heat sealing film for sealing Root Plates prior to tissue disruption |
Duck Brand Extra Wide Packaging Tape, 3.00″ x 54.6 yd | OfficeMax www.officemax.com |
Item no. 21242139 | Adhesive tape for sealing microplates containing DNA extracts for storage |
Sealing Roller | Bio-Rad | MSR-0001 | Hand held rolling tool for pressing adhesive sealing tape onto microplates |
96-well metal thermal block | Cole-Parmer | 36400-66 | Used to freeze the Root Plates for tissue harvest |
Whatman Filter paper | Whatman International | 1002 090 | Used for surface sterilizing seeds |
Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | 5 ¾”disposable Pasteur pipette used for transferring seeds to Seedling Plate |
Pyrex baking dish (20 cm x 30 cm) | Target Department Store | Used to construct a dry ice/ethanol bath. |