The Ice-Cap-metoden gör att man kan odla växter i 96-brunnar och icke-förstörande skörd rot vävnad från varje planta. DNA extraherat från denna rot vävnad kan användas för genotypning reaktioner. Vi har funnit att Ice-Cap fungerar bra för<em> Arabidopsis thaliana</em>, Tomat och ris plantor.
Det blir vanligt att anläggningen forskare att utveckla projekt som kräver genotypning av ett stort antal växter. Det första steget i en genotypning projektet är att samla ett vävnadsprov från varje enskild anläggning. Den traditionella metoden att denna uppgift är att smaka växter en-på-ett-tiden. Om man vill genotyp hundratals eller tusentals individer, dock med hjälp av denna strategi resulterar i en betydande flaskhals i genotypning gång. The Ice-Cap metod som vi beskriver här ger en hög genomströmning lösning på denna utmaning genom att låta en forskare att samla in vävnad från flera tusen plantor på en enda dag 1,2. Denna nivå av genomströmning är möjligt tack vare det faktum att vävnaden är skördade från växter 96-i-ett-tiden, snarare än en-på-ett-tiden.
The Ice-Cap-metoden ger en integrerad plattform för att utföra plantor tillväxt, vävnad skörd, och DNA-extraktion. Grunden för Ice-Cap är tillväxten av seedlings i en staplad par plattor med 96 brunnar. Brunnarna i övre plattan innehåller pluggar media agar tillväxt på vilka enskilda plantor gro. Rötterna växer ner genom agar media, avslutar den övre plattan genom ett hål, och övergå i en lägre skylt som innehåller vatten. Att skörda vävnad för DNA-extraktion, vattnet i den nedre plattan innehåller roten vävnad snabbt fryses medan plantorna i den övre plattan förvaras i rumstemperatur. Den övre plattan är sedan skalade bort från undre plattan, vilket ger en tallrik med 96 prover rot vävnad frysta i isen och en tallrik med 96 livskraftiga plantor. Tekniken heter "Ice-Cap" eftersom den använder isen för att fånga roten vävnad. Den 96-brunnar som innehåller plantor kan sedan insvept i folie och överföras till låg temperatur. Denna process avbryter ytterligare tillväxt av plantor, men påverkar inte deras livskraft. När genotyp analys har slutförts kan plantor med önskade genotyp överföras från 96-bra psent att marken för vidare förökning. Vi har visat nyttan av Ice-Cap-metoden med hjälp av Arabidopsis thaliana, tomat, och plantor ris. Vi förväntar oss att metoden även bör gälla för andra arter av växter med frön liten nog att passa in i brunnarna i 96-hålsplattor.
The Ice-Cap metoden som presenteras här ger en vetenskapsman för att samla in vävnadsprover från hundratals, eller tusentals, i enskilda anläggningar på en enda dag och effektivt utvinna genomisk DNA från dessa prover för användning i genotypning reaktioner. Genom att ge en enskild forskare möjlighet att genotyp tusentals plantor under en kort tid har Ice-Cap metoden kan underlätta en rad genetiska experiment som annars inte skulle vara praktiskt att utföra. Flera exempel finns nedan.
Tanken bakom iTILLING är att producera en kortlivad mutant befolkning, vilket står i kontrast till den hållbara muterade populationer som skapats för traditionell markberedning projekt. För iTILLING är frön från en bulk M2 befolkning sått i 50 till 100 block Ice Cap, och DNA extraheras med Ice-Cap-metoden. Arabidopsis plantor sedan placeras vid 4 ° C medan mutation screening utförs med hjälp av Ice-Cap DNA preps. Tomat plantor lagras vid 12 ° C.. När plantor bär önskade mutationer har identifierats, de återhämtat sig från Ice-Cap plattor och överföras till jord. iTILLING är inte avsedd att ge en långvarig mutant befolkningen för en hel forskarsamhället till skärmen. Istället ger iTILLING en strategi genom vilkenen vetenskapsman kan skärmen en anpassad mutant befolkningen för mutationer i ett fåtal gener snabbt, effektivt och till en relativt låg kostnad.
Vi har funnit Is-Cap vara en effektiv metod för växande och genotypning Arabidopsis, tomat och ris. Vi förväntar oss att andra arter av växter även bör vara möjligt att Ice-Cap. En begränsning om de olika arter som kan rymmas i Ice-Cap är storleken på frön. Endast växter med frön liten nog att passa in i brunnar i en 96-brunnar kommer att vara kompatibla med Ice-Cap i sin nuvarande konfiguration.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats genom anslag från National Science Foundation (licensnummer MCB-0.447.750).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
GenoGrinder | Spex/CertiPrep, Metuchen, NJ | 2000 Geno/Grinder | Machine for shaking Root Plates for DNA extraction |
ABgene Thermo-Sealer | ABgene USA | AB-0384 | Manual heat sealing machine used to Root Plates prior to tissue disruption |
Centrifuge equipped with swinging microplate carriers | Beckman Coulter | Allegra 25R | Any centrifuge with swinging microplate carriers would be suitable |
MicroFill Microplate Dispenser | BioTek www.biotek.com |
AF1000A | Automated liquid dispenser for filling microplates |
Bialetti brand 17×11 inch Commercial Large Cookie Sheet | Target Department Store | www.bialetti.com | This specific cookie sheet has the ideal depth for Ice-Cap |
Custom Made Metal Rack | Hardware Store | See text for full description | |
33 Liter plastic storage box | Target Department Store | Sterilite Brand | For Ice-Cap Fountain. Plastic storage box large enough to hold the 17×11 inch cookie sheet |
30 gallon per hour Fountain Pump | Sunterra | 104506 | Small submersible fountain pump available at garden supply stores |
Hose for fountain pump | Any lab supply company | Hose compatible with fountain pump | |
Plastic Clamp | Hardware Store | Clamp to hold hose to cookie sheet | |
Clear plastic lids from Falcon Microtest flat bottom 96-well polystyrene plates | BD Falcon www.bdbiosciences.com |
351172 | Clear plastic lids for covering Ice-Cap Seedling Plates |
3M Micropore surgical tape | Fisher Scientific | 19-027-761 | |
3/32-inch diameter stainless steel balls | Hartford Technologies, Rocky Hill, CT | 034-006-1K | Used to disrupt root tissue after harvest |
3 inch Elastic hair bands | Local grocery store | Used to secure Root Plate to Seedling Plate | |
4 mm diameter wooden skewers | Local grocery store | These skewers are typically used to prepare kabobs | |
Fisher Scientific Nunc brand, 1-mL filter plates without frit | Fisher Scientific | 278012 | 96-well Seedling Plates with holes in bottom. |
Fisherbrand 96-Well Tall-Chimney PCR Plate | Fisher Scientific | 14-230-242 | 96-well Root Plates |
Agar – cell culture tested | Sigma-Aldrich | A1296 | |
4-Morpholinoethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M2933 | |
Murashige and Skoog (MS) basal salt mixture | Sigma-Aldrich | M-5524 | |
Easy Peel heat sealing foil | ABgene USA | AB-0745 | Heat sealing film for sealing Root Plates prior to tissue disruption |
Duck Brand Extra Wide Packaging Tape, 3.00″ x 54.6 yd | OfficeMax www.officemax.com |
Item no. 21242139 | Adhesive tape for sealing microplates containing DNA extracts for storage |
Sealing Roller | Bio-Rad | MSR-0001 | Hand held rolling tool for pressing adhesive sealing tape onto microplates |
96-well metal thermal block | Cole-Parmer | 36400-66 | Used to freeze the Root Plates for tissue harvest |
Whatman Filter paper | Whatman International | 1002 090 | Used for surface sterilizing seeds |
Disposable Pasteur Pipette | Fisher Scientific | 13-678-6A | 5 ¾”disposable Pasteur pipette used for transferring seeds to Seedling Plate |
Pyrex baking dish (20 cm x 30 cm) | Target Department Store | Used to construct a dry ice/ethanol bath. |