Anesthetized चूहा में सिलिकॉन जांच के साथ बड़े पैमाने पर Neuronal Ensembles रिकॉर्डिंग
Summary
Neuronal गतिविधि के बाह्य रिकॉर्डिंग anesthetized चूहे में सिलिकॉन जांच का उपयोग वर्णित किया जाएगा. इस तकनीक को कई मस्तिष्क क्षेत्रों में एक साथ 100 से अधिक न्यूरॉन्स से जानकारी प्राप्त की अनुमति देता है. यह एकल कक्ष संकल्प के साथ कई स्थानीय सर्किट में neuronal ensembles गतिशीलता के बारे में जानकारी प्रदान करता है.
Abstract
Neuronal ensembles से बड़े पैमाने पर electrophysiological रिकॉर्डिंग जांच करने के लिए कैसे मस्तिष्क अपने न्यूरॉन्स के spiking गतिविधि से व्यवहार की एक विस्तृत विविधता orchestrates का अवसर प्रदान करते हैं. एकाधिक स्थानीय neuronal सर्किट में न्यूरॉन्स की एक बड़ी संख्या से spiking गतिविधि की निगरानी के लिए सबसे प्रभावी तरीकों में से एक साथ सिलिकॉन इलेक्ट्रोड 1-3 arrays का उपयोग कर रहा है.
लड़ाई क्षमता सेल somata के आसपास के क्षेत्र में बड़ी transmembrane वोल्टेज परिवर्तन का उत्पादन. ये आउटपुट संकेतों को एक न्यूरॉन के करीब निकटता में एक कंडक्टर रखकर मापा जा सकता है है. यदि वहाँ कई टिप के आसपास के क्षेत्र में सक्रिय (spiking) न्यूरॉन्स, इलेक्ट्रोड उन सभी को, जहां एक न्यूरॉन का योगदान अपनी 'बिजली दूरी' के आधार पर भारित है से संयुक्त संकेत रिकॉर्ड. सिलिकॉन जांच आदर्श रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड रिकॉर्डिंग (64) साइटों और एक छोटी मात्रा की एक बड़ी संख्या की वजह से कई न्यूरॉन्स की निगरानी कर रहे हैं. Furthermoफिर से, कई साइटों मिलीमीटर की दूरी पर व्यवस्थित किया जा सकता है, इस प्रकार विभिन्न cortical परतों में या एकाधिक cortical कॉलम में neuronal गतिविधि के युगपत रिकॉर्डिंग (1 छवि) के लिए अनुमति देता है. महत्वपूर्ण बात है, रिकॉर्डिंग साइटों की ज्यामितीय सटीक वितरण भी पृथक एकल न्यूरॉन्स 4 के स्थानिक संबंधों के निर्धारण के लिए अनुमति देता है. यहाँ, हम एक तीव्र, बड़े पैमाने पर सिलिकॉन जांच (छवि 2) के साथ एक anesthetized चूहे में बाएँ और दाएँ forelimb somatosensory एक साथ प्रांतस्था से neuronal रिकॉर्डिंग का वर्णन करता है.
Protocol
1. सर्जरी तैयारी उचित प्रकार और anesthetics की खुराक के साथ चूहे anesthetize. यहाँ हम urethane (1.5 ग्राम / किलो, सिग्मा Aldrich कं, सेंट लुइस, MO) का उपयोग करें – 20% समाधान के रूप में फॉस्फेट की 100 मिलीलीटर में urethane के 20 ग्राम गिराए द्वारा तैयार जानवर यानी खारा (पीबीएस) buffered 7.5 प्राप्त करेंगे / एमएल urethane समाधान intraperitonealy किलो (आईपी). इसकी खुराक – प्रतिक्रिया वक्र की वजह से, urethane की कुल खुराक चार अनुप्रयोगों, प्रत्येक लगभग 30 मिनट के द्वारा अलग में विभाजित है. Urethane के पहले दो आवेदनों से पहले, पशु (2 लीटर प्रति मिनट पर ऑक्सीजन) 3-4% की एकाग्रता पर isoflurane प्रशासित (2 लीटर प्रति मिनट के लिए ऑक्सीजन) के साथ 2% से कम बनाए रखा anesthetized से एक जानवर को रोकने के इंजेक्शन द्वारा बल दिया हो रही है. शल्य चिकित्सा के दौरान, isofluorane (2 मिनट के लिए 2% एकाग्रता) के एक अतिरिक्त प्रशासन इस्तेमाल किया जा सकता है अगर जरूरत है. चीरा साइट (सिर के पृष्ठीय पक्ष) के साथ फर दाढ़ी है कि यह सुनिश्चित करने के लिएफर घाव नहीं दूषित होगा और पर्याप्त क्षेत्र चीरा साइट के आसपास कीटाणुरहित किया जा सकता है है कि. शल्य साइट तैयार विकार – निवारक के रूप में कार्बनिक आयोडीन या chlorhexidine साबुन और दवाइयों (इथेनॉल) का उपयोग कर. सिलिकॉन जांच (NeuroNexus टेक्नोलॉजीज, Ann Arbor, MI) तैयार करें. जांच 70% आसुत जल के साथ rinsing द्वारा पीछा इथेनॉल का उपयोग कीटाणुरहित किया जा सकता है. यदि आवश्यक हो, जांच एक फ्लोरोसेंट मार्कर विकार – निवारक के रूप में तैयार (जैसे डाई मैं, Invitrogen कं), बाद में histological विश्लेषण में जांच की स्थिति प्रकट के साथ चित्रित किया जा सकता है. ऐसा करने के लिए हम एक छोटे और बहुत नरम पेंट ब्रश का उपयोग करें और नाजुक डाई के साथ सिलिकॉन जांच की पीठ को छूने. यह प्रक्रिया हमेशा के लिए यकीन है कि जांच या क्षतिग्रस्त नहीं किया जा रहा है तुला खुर्दबीन से अधिक किया जाना चाहिए. हमेशा की जांच करने के लिए यकीन है कि डाई चैनलों की किसी भी अवरुद्ध नहीं है. कोई अवशिष्ट जांच पर छोड़ दिया डाई बाद में शराब के साथ हटाया जा सकता है, पानी के साथ rinsing द्वारा पीछा किया. सिलिकॉन Electrodतों देखभाल: अपने छोटे आकार की वजह से, सिलिकॉन जांच नाजुक और अत्यंत भी तोड़ जब यह काफी देखभाल के साथ प्रयोग के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं. इस प्रकार, हम जैसे सभी बार, पर संभावित खतरों की निगरानी करने की सलाह देते हैं: (i) एक उचित नामित बॉक्स में जांच रखें, (ii) दुर्घटनाग्रस्त रोकें या जांच छोड़ने जब उन्हें संभाल, (iii) यह सुनिश्चित करें कि stereotaxic manipulators अच्छी तरह से तय कर रहे हैं किसी भी दुर्घटनाओं को रोकने के लिए, (iv) जब रिकॉर्डिंग, आसपास के ऊतकों और / या रक्त जांच करने के लिए संलग्न कर सकते हैं. इसलिए, यह महत्वपूर्ण है के लिए भी सावधान हो जब रिकॉर्डिंग के बाद जांच हटाने. पीबीएस या खारा समाधान के एक निरंतर प्रवाह का उपयोग करना पुरजोर सिफारिश की है, (v) हमेशा रिकॉर्डिंग के बाद जांच साफ. जांच को साफ करने के लिए, यह दृढ़ता से कुछ मिनट के लिए एक तरल एंजाइमी क्लीनर (बोस्टन, Bausch & Lomb) में उन्हें डूब सिफारिश की. हमेशा आसुत जल के साथ जांच कुल्ला और उन्हें अपने समर्पित बॉक्स में लौटने. हमारे अनुभव में, सिलिकॉन जांच की पर्याप्त देखभाल सुनिश्चित करता है10 से अधिक प्रयोगों के लिए अच्छी गुणवत्ता रिकॉर्डिंग. अगर एक चैनल का उपयोग के दौरान 'शोर' हो जाता है है, यह बाद के विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए. हमने पाया है कि चैनलों के बीच पार बात कम है, इसलिए आमतौर पर एक शोर चैनल अन्य चैनलों में एक संकेत पर बहुत थोड़ा प्रभाव है. 2. सर्जरी आंख की सतह पर किसी भी सर्जरी जोड़तोड़ के पहले एक आँख मरहम लागू करें. प्रशासन Dexamethasone 5 मिलीग्राम / एमएल subcutaneously मस्तिष्क में सूजन को कम. सर्जरी भर stereotaxic फ्रेम में पशु फिक्स. Lidocaine एचसीएल (2-4 मिलीग्राम / किग्रा 0.5% समाधान के लिए पतला) चीरा साइट पर subcutaneously एपिनेफ्रीन के साथ 2% प्रशासन पहले चीरा घाव से खून बह रहा और स्थानीय संज्ञाहरण के लिए संभावित खतरे को कम करने के लिए किया जाता है. खोपड़ी midline के माध्यम से एक 2 सेमी चीरा और त्वचा laterally विस्थापित खोपड़ी सतह बेनकाब. प्रावरणी से कुंद विच्छेदन और नियंत्रण द्वारा पृष्ठीय खोपड़ी साफ़microcautery द्वारा या हड्डी मोम का उपयोग करके खून बह रहा है. दो ड्रिलिंग छेद बनाओ जानवर ग्राउंडिंग और संदर्भ के लिए खोपड़ी के पश्चकपाल हड्डी में छोटे शिकंजा देते हैं. संदर्भ पेंच dura के साथ संपर्क में होना चाहिए. आदेश में रिकॉर्डिंग के दौरान बिजली के शोर को कम करने के लिए, यह के सभी समय पर गीला शिकंजा रखने की सिफारिश की है. ऐसा करने के लिए, एक छोटे ऐक्रेलिक शिकंजा आसपास बाधा या बनाया जा सकता है शिकंजा अगर साथ कवर किया जा सकता है. 5 ब्याज की cortical और / या subcortical क्षेत्र (ओं) को इसी निर्देशांक में 1-2 मिमी व्यास कपाल – उच्छेदन बनाओ. संपीड़ित हवा का उपयोग हड्डी धूल हटाने के रूप में कपाल – उच्छेदन (ड्रिलिंग छेद) के दौरान की जरूरत है. रोकें खोपड़ी ड्रिलिंग से पीबीएस की बूँदें लागू करने के द्वारा गर्म. अगर दूसरी जांच सम्मिलित करने की जरूरत एक दूसरे कपाल – उच्छेदन बनाओ. इस वीडियो में, हम दो cortical क्षेत्रों से एक रिकॉर्डिंग प्रस्तुत कर रहे हैं एक साथ, इसलिए दो craniotomies बना रहे हैं. लैंग चिकित्सकीय: ऐक्रेलिक राल के एक छोटे से बाधा (जैसे बनाएँविनिर्माण, कं, Inc, Wheeting, आईएल) दो craniotomies आसपास के क्रम में उजागर dura के शीर्ष पर पीबीएस रखने के लिए, इसे सूखने से रोकने. पीबीएस लागू लगातार पूरे प्रयोग के दौरान. दोनों craniotomies के dura बात खोलें. दो सुइयों (30 साढ़े गेज) युक्तियाँ (एक हुक बनाने) पर bended इस हेरफेर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Stereotaxic manipulatiors सिलिकॉन जांच की संबंधक संलग्न. कनेक्टर्स एक पोल से जुड़े होते हैं क्रम में करने के लिए पूरी तरह से stereotaxic जोड़तोड़ के समानांतर जांच की shanks है. यह स्थिर रिकॉर्डिंग को बनाए रखने के लिए और जांच क्षति से बचने के लिए महत्वपूर्ण है. संदर्भ पेंच सिलिकॉन जांच संदर्भ पिन कनेक्ट. Ii) हवाई जहाज़ के पहिये रिकॉर्डिंग डिवाइस से जमीन और iii) stereotaxic फ्रेम) मैं जांच प्लग की जमीन: बिजली के शोर कम जमीन से जुड़ा होना शिकंजा. पिया के साथ संपर्क में सिलिकॉन जांच की टिप प्लेस. धीरे धीरे वें परिचयई सिलिकॉन जांच और यकीन है कि सिलिकॉन जांच (छवि 1 और 2) के shanks प्रतिरोध या झुकने के बिना मस्तिष्क में डाला जा सकता है. ध्यान से वांछित रिकॉर्डिंग क्षेत्र तक पहुँचने तक जांच कम है. यदि आवश्यक हो, craniotomies के शीर्ष पर पीबीएस की बूँदें जोड़ने के लिए ऊतक के सूखने से बचने. क्योंकि urethane संज्ञाहरण केवल टर्मिनल प्रक्रियाओं के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, पशु सोडियम की कम से कम 200mg/kg के एक आईपी इंजेक्शन द्वारा euthanized है pentobarbital कोई 60 से अधिक मिलीग्राम / एमएल के एक एकाग्रता के लिए पतला. इस जानवर के कत्ल के द्वारा पीछा किया जाता है. 3. प्रतिनिधि परिणाम: स्थानीय क्षेत्र क्षमता और spiking गतिविधि के प्रतिनिधि रिकॉर्डिंग चित्रा 3A में सचित्र हैं. स्पाइक छँटाई (चित्र 3B, सी; भेदभाव विभिन्न न्यूरॉन्स से होने वाले spikes के 6, 7, 8) प्रदर्शन के बाद सिलिकॉन जांच रिकॉर्डिंग neuronal आबादी में शामिल गतिविधि की जांच करने की क्षमता प्रदान करते हैं रहा हूँअन्य ong, निम्नलिखित प्रक्रियाओं: स्मृति और निर्णय 9 बनाने, 10 plasticity, उत्तेजना कोडन 11, सहज गतिविधि 12 और विभिन्न 13 दवाओं के प्रभाव. चित्रा 1. एक एकल टांग के साथ एक सिलिकॉन जांच की ए उदाहरण खंगाला न्यूरॉन्स (एस Sakata 14 के सौजन्य) के एक संग्रथित पर आरोपित 8 shanks में से प्रत्येक में एक tetrode विन्यास के साथ एक जांच के उदाहरण बी. सी. एक के योजनाबद्ध चूहे की खोपड़ी. हरी बक्से सही है और छोड़ दिया somatosensory प्रांतस्था अधिक कपाल – उच्छेदन की हद तक का प्रतिनिधित्व करते हैं. चित्रा 2 सिलिकॉन prefrontal प्रांतस्था और हिप्पोकैम्पस में सम्मिलित जांच के साथ प्रयोग का उदाहरण है. पीबीएस के गिरता कपाल – उच्छेदन को कवर करने के लिए रक्षा उजागर brसूखने से ऐन. दो सेरिबैलम पर स्थित शिकंजा जमीन और संदर्भ से जोड़ा जाएगा, क्रमशः. चित्रा 3. ए छवि एक tetrode (ध्यान दें: नकारात्मक वोल्टेज तालमेल पर प्लॉट किए जाते है) से एक प्रतिनिधि स्थानीय फील्ड संभावित (LFP) के electrophysiological रिकॉर्डिंग के 500ms से पता चलता है. – एक कील बी के एक तरंग दो आयामी 1 tetrode से सुविधा अंतरिक्ष में इकाई समूहों के विचारों सम्मिलित दिखाता है. प्रत्येक क्लस्टर में एक एकल इकाई (न्यूरॉन) से spikes का प्रतिनिधित्व करता है समय के साथ सी. औसत स्पाइक प्रतिनिधि इकाइयों से waveforms (कोडित रंग) एक एकल tetrode से चार रिकॉर्डिंग साइटों की प्रत्येक पर डी. तरंग की ऊर्जा (आयाम से संबंधित). दर्ज spikes के. . नोट प्रत्येक इकाई के लिए अपेक्षाकृत स्थिर ऊर्जा मूल्यों, यह प्रदर्शित अवधि की अवधि के ऊपर एक स्थिर रिकॉर्डिंग इंगित करता है.
Discussion
इस कागज को दर्शाता है कैसे सिलिकॉन इलेक्ट्रोड सरणियों का उपयोग करने के लिए एक साथ कई cortical क्षेत्रों में न्यूरॉन्स (100) की बड़ी आबादी से रिकॉर्ड है. सर्जरी और रिकॉर्डिंग में आदेश में सफल होने के लिए, निम्नलिखित मुद्दों पर विचार किया जाना चाहिए:
- एक वांछित क्षेत्र के लिए जांच का परिचय: जब मस्तिष्क के ऊतकों में जांच डालने, यह काफी नुकसान का कारण करने के लिए संभव है. यह दर्ज इकाइयों के एक कम गुणवत्ता में परिणाम कर सकते हैं. इस समस्या से बचने के लिए हम निम्नलिखित सुझाव है: (i) एक निश्चित डिग्री के कोण पर जांच (एक 10 डिग्री के कोण का उपयोग करने के लिए सिफारिश की) का परिचय. ऐसा करने से दर्ज न्यूरॉन्स के वृक्ष के समान नुकसान कम किया जा सकता है, (ii) के बाद जांच मस्तिष्क के ऊतकों में डाला जाता है, वे शुरू में एक तेज दर (10-30 प्रति सेकंड लगभग 50 से 100 microns) कम कर रहे हैं जब तक वे रिकॉर्डिंग के वांछित क्षेत्र के करीब है. जब जांच लक्ष्य क्षेत्र से 200 माइक्रोन के बारे में हैं, तो स्थिति और अधिक धीरे – धीरे निकाला जाता है (लगभगimately 10 हर 2 या 3 मिनट microns).
- रिकॉर्डिंग: स्थिरीकरण जब जांच नामित क्षेत्र में हैं और काफी गतिविधि (चैनलों के बहुमत में विशिष्ट spikes) का पता चला है, यह एक रिकॉर्डिंग शुरू करने से पहले लगभग 30 मिनट तक प्रतीक्षा की सिफारिश की है. यह मस्तिष्क के ऊतकों यंत्रवत् जांच के सम्मिलन के बाद स्थिर करने के लिए और एक अधिक स्थिर रिकॉर्डिंग सुनिश्चित की अनुमति देगा.
- ब्रेन धड़कन: कभी कभी यह संभव है मस्तिष्क धड़कन उल्लेखनीय है कि एक रिकॉर्डिंग की गुणवत्ता को कम कर सकते हैं देख. एक छोटे कपाल – उच्छेदन (अभी पर्याप्त अंतरिक्ष जांच फिट) एक रिकॉर्डिंग क्षेत्र में मस्तिष्क धड़कन को कम कर सकते हैं. यदि आवश्यक हो, महाकुण्ड पंचर किया जा सकता है. यह मस्तिष्कमेरु द्रव का दबाव कम कर देता है और सूजन और धड़कन कम हो जाती है.
- सिलिकॉन जांच विन्यास: सिलिकॉन जांच आकृतियों और रिकॉर्डिंग साइट विन्यास की एक किस्म है सकते हैं. उदाहरण के लिए, वे shanks, और shanks की लंबाई और मोटाई की संख्या में भिन्न कर सकते हैं, और मेंरिकॉर्डिंग साइटों (;: www.neuronexustech.com देख जैसे tetrode बनाम रैखिक विन्यास) की व्यवस्था. जांच की पसंद एक विशिष्ट विन्यास के साथ प्रयोग किया जाता वैज्ञानिक की जरूरत प्रश्न के जवाब पर निर्भर करता है. उदाहरण के लिए, यदि उद्देश्य के लिए एक विशिष्ट परत (के रूप में इन रिकॉर्डिंग में प्रस्तुत) में कई स्थानों में न्यूरॉन्स की आबादी रिकॉर्ड है, सबसे अच्छा विकल्प के लिए आठ shanks और एक tetrode विन्यास के साथ एक जांच का उपयोग करने के लिए है. यह एकाधिक एकल इकाइयों के प्रत्येक और एक 1.4mm अवधि भर में आठ स्थानों की tetrode नमूने में रिकॉर्डिंग के लिए अनुमति देता है. एक अन्य उदाहरण में, अगर किसी को cortical परतों में गतिविधि propagations अध्ययन करना चाहते हैं, तो सबसे अच्छा विकल्प एक टांग के साथ नियमित रूप से जो कई cortical परतों में रिकॉर्डिंग के साथ 14 की अनुमति देता है है कि टांग के साथ वितरित रिकॉर्डिंग साइटों के साथ एक जांच का उपयोग होगा.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम NSERC और AHFMR द्वारा समर्थित किया गया. लेखकों Hiroe और Yamazaki पांडुलिपि पर टिप्पणियों के लिए सर्जरी की तैयारी पर मदद के लिए मरियम Alaverdashvili और अमांडा Mauthe – Kaddoura धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalogue Number |
| Urethane | Sigma-Aldrich | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | ||
| Isoflurane | Benson | 02241315 |
| Silicon probes | NeuroNexus Technologies | A 4 X 2 – Tet – 5mm – 150 – 200 – 312 |
| Dye I (DiIC18(3)) | Invitrogen Co. | 617830 |
| Dexamethasone 5 | Vetoquinol | 0A0640B |
| Eye ointment | Vetoquinol | 005165414 |
| Lidocaine HCl 2% with Epinephrine | Bimeda-MTC | 00141984 |
| Stereotaxic Frame | KOPF Instruments | 1430-B |
| Electrode manipulator and holder | KOPF Instruments | 960 |
| Rat ear-bars | KOPF Instruments | 1955 |
| Rat adaptor | KOPF Instruments | 920 |
| Anaesthesia mask | KOPF Instruments | 906 |
| Scalpel | Roboz Surgical Instruments | RS-9843 |
| Scalpel blades | Paragon | 0086 |
| Micro dissecting scissors | Roboz Surgical Instruments | RS-5910 |
| Screws | Gould Pasteners Limited | 14084701 |
| Hemostatic forceps | Roboz Surgical Instruments | RS-7130 RS-7211 |
| 30½ gauge needles | Becton-Dickinson | 305115 |
| Micromotor control | Foredom | HP4-917 |
| Dissecting forceps | Roboz Surgical Instruments | RS-5237 |
| Bone wax | Lukens | M263500 |
| Compressed air bottle | Falcon safety products, Inc. | 50-10521C |
| Enzymatic cleaner | Boston, Bausch & Lomb | BAUSCH497628 |
| Distilled water | ||
| Dental acrylic powder | Lang Dental | 1220 |
| Dental acrylic liquid | Lang Dental | 1404 |
| Digital Lynx SX System | Neuralynx Inc. | 4SX-Z400 |
| Cheeta Softwere | Neuralynx Inc. | |
| Alligator cables |
Riferimenti
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Citazione di questo articolo
Schjetnan, A. G. P., Luczak, A. Recording Large-scale Neuronal Ensembles with Silicon Probes in the Anesthetized Rat. J. Vis. Exp. (56), e3282, doi:10.3791/3282 (2011).