Hos mus, er evnen til å oppdage feromoner medieres hovedsaklig via vomeronasal organ (VNO). Her er en akutt vev skive utarbeidelse av VNO for å utføre kalsium avbildning beskrevet. Denne fysiologiske tilnærmingen gjør observasjoner av subpopulasjoner og / eller enkelte nevroner i en levende vev og er praktisk for reseptor-ligand identifikasjon.
Peter Karlson og Martin Lüscher brukte begrepet feromon for første gang i 1959 1 å beskrive kjemikalier som brukes for intra-arter kommunikasjon. Feromoner er flyktige eller ikke-flyktige kortvarig molekyler to skilles og / eller inntatt i biologiske væsker 3,4, som urin, en væske kjent for å være en hovedkilde av feromoner 3. Pheromonal kommunikasjon er innblandet i en rekke viktige dyr modaliteter som pårørende interaksjoner 5,6, hierarkiske organisasjoner 3 og seksuell samhandling 7,8 og er dermed direkte korrelert med overlevelsen av en gitt art 9,10,11. Hos mus, er evnen til å oppdage feromoner medieres hovedsaklig via vomeronasal organ (VNO) 10,12, en sammenkoblet struktur plassert på bunnen av nesehulen, og omsluttet av en cartilaginous kapsel. Hver VNO har et rørformet form med et lumen 13,14 slik at kontakten med eksternekjemisk verden. Den sensoriske neuroepithelium er hovedsakelig sammensatt av vomeronasal bipolar sensoriske nevroner (VSNs) 15. Hver VSN strekker et enkelt dendrite til lumen ender i en stor dendrittiske knotten bærer opptil 100 microvilli innblandet i kjemiske deteksjon 16. Tallrike subpopulasjoner av VSNs er til stede. De er differensiert ved chemoreceptor de uttrykker og dermed muligens av ligand (e) de anerkjenner 17,18. To viktigste vomeronasal receptor familier, V1Rs og V2Rs 19,20,21,22, er komponert henholdsvis 240 23 og 120 24 medlemmer og er uttrykt i separate lag av neuroepithelium. Olfactory reseptorer (ORS) 25 og formyl peptid reseptorer (FPRs) 26,27 er også uttrykt i VSNs.
Hvorvidt disse neuronal subpopulasjoner bruke samme nedstrøms signalveien for sensing feromoner er ukjent. Til tross for en stor rolle spilt av en kalsium-gjennomtrengelig kanal (TRPC2) tilstede i microvilli av modne nevroner 28 TRPC2 uavhengige transduksjon kanaler har blitt foreslått 6,29. På grunn av det høye antallet neuronal subpopulasjoner og særegne morfologi av orgelet, farmakologiske og fysiologiske undersøkelser av signalering elementer til stede i VNO er komplekse.
Her presenterer vi en akutt vev slice utarbeidelsen av musen VNO for utføring av kalsium avbildning undersøkelser. Denne fysiologiske tilnærmingen gjør observasjoner i det naturlige miljøet til en levende vev, generelle eller individuelle subpopulasjoner av VSNs tidligere lastet med Fura-2am, en kalsium fargestoff. Denne metoden er også praktisk for å studere eventuelle GFP-merket feromon reseptoren og kan tilpasses for bruk av andre fluorescerende kalsium sonder. Som et eksempel, bruker vi her en VG mus 30 linje, der oversettelsen av feromon V1rb2 reseptoren er knyttet til uttrykket av GFP av en polycistronic strategi. </p>
Den kalsium bildebehandling Metoden som presenteres her gjør det mulig å ta opp, i en akutt slice forberedelse, pheromonal svarene av mus VNO nerveceller. Med denne tilnærmingen, er disseksjon fra dyret til vomeronasal nevroner, med litt øvelse, lett oppnåelig og gir en lang levende vev forberedelse. Den tillater tidkrevende eksperimenter som farmakologiske undersøkelser eller studiet av pheromonal koding. Med denne fysiologiske teknikken kan store bestander samt presis neuronal subpopulasjoner bli analysert spesielt. I tillegg kan denne metoden kan enkelt tilpasses immunhistokjemisk tilnærminger eller eksperimenter basert på andre kalsium fargestoffer. Bruken av disse kombinerte metoder vil sikkert tillate identifisering av nye pheromonal ligander for de mange foreldreløse chemoreceptors uttrykt i musen vomeronasal organ.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å takke spesielt Monique Nenniger Tosato for henne utmerket teknisk støtte samt Jean-Yves Chatton for sin vitenskapelige råd og imaging CIF plattform UNIL for mikroskopet utstyret. Finansieringen ble gitt av den sveitsiske National Science Foundation.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Adenosine 5’-triphosphate disodium salt solution (ATP) | Sigma-Aldrich | A6559-25UMO | |
Agar | Sigma-Aldrich | A7002-100G | Preferentially for immunohistochemistry |
Agar (low-melting) | Sigma-Aldrich | A0701-25G | Preferentially for calcium imaging |
CL-100 Bipolar Temperature Controller | Warner Instruments | W64-0352 | |
Confocal Microscope | Leica Microsystems | SP5 AOBS | |
Cy5-AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 115-175-071 | Protect from light |
DMSO (Dimethyl Sulfoxide) | Merck | 317275-100ML | |
Embedding molds, Peel-A-Way | Polysciences | 18646A-1 | 22 x 22 x 20 mm |
Fluorescent mounting media (Vectashield with DAPI, 10 ml) | Rectolab | H-1200 | |
FURA-2AM | Teflabs | 0103 | Protect from light |
Glisseal N (vacuum grease, 60 g) | Borer Chemie | Glisseal N | |
Large bath recording chamber (RC-26G) | Warner Instruments | 64-0235 | |
MetaFluor (software for calcium imaging; v.7.6.5.0) | Visitron Systems | ||
Monoclonal Anti-Tubulin, acetylated Mouse antibody | Sigma-Aldrich | T6793-.2ML | |
Normal goat serum (NGS, 10 ml) | Interchim | UP379030 | |
Platform for chambers (P-1) | Warner Instruments | 64-0277 | |
Pluronic F-127, 2 g | Invitrogen | P-6867 | |
Roti Coll (Dosing bottle, 10 g) | Carl Roth | 0258.1 | |
SC-20 Dual In-line Solution heater/Cooler | Warner Instruments | W64-0353 | |
Slice anchor (SHD-26GKIT) | Warner Instruments | 64-0266 | |
Stereofluorescence microscope | Leica Microsystems | MZ16FA | |
Super PAP PEN (hydrophobic pen) | Pelco International | 22309 | |
Triton X-100 | Fluka | 93420-250ML | |
Vibrating blade microtome VT 1200S | Leica Microsystems | 14048142066 | |
VisiChrome high speed polychromator system | Visitron Systems | ||
3D Data Visualization (Imaris; v.6.3.1) | Bitplane Scientific Software |