GENPLAT : منبرا الآلي لاكتشاف انزيم الكتلة الحيوية والتحسين كوكتيل

Summary

GENPLAT (GLBRC منهاج أنزيم) هو منصة الآلي لاكتشاف والاستفادة المثلى من الكوكتيلات انزيم لتدهور الكتلة الحيوية. ويمكن تكييفه مع المواد الأولية متعددة وخليط من الانزيمات التي تحتوي على مكونات متعددة.

Abstract

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid transportation fuels such as ethanol. We have developed an integrated high throughput platform, called GENPLAT, for the discovery and development of novel enzymes and enzyme cocktails for the release of sugars from diverse pretreatment/biomass combinations. GENPLAT comprises four elements: individual pure enzymes, statistical design of experiments, robotic pipeting of biomass slurries and enzymes, and automated colorimeteric determination of released Glc and Xyl. Individual enzymes are produced by expression in Pichia pastoris or Trichoderma reesei, or by chromatographic purification from commercial cocktails or from extracts of novel microorganisms. Simplex lattice (fractional factorial) mixture models are designed using commercial Design of Experiment statistical software. Enzyme mixtures of high complexity are constructed using robotic pipeting into a 96-well format. The measurement of released Glc and Xyl is automated using enzyme-linked colorimetric assays. Optimized enzyme mixtures containing as many as 16 components have been tested on a variety of feedstock and pretreatment combinations.

GENPLAT is adaptable to mixtures of pure enzymes, mixtures of commercial products (e.g., Accellerase 1000 and Novozyme 188), extracts of novel microbes, or combinations thereof. To make and test mixtures of ˜10 pure enzymes requires less than 100 μg of each protein and fewer than 100 total reactions, when operated at a final total loading of 15 mg protein/g glucan. We use enzymes from several sources. Enzymes can be purified from natural sources such as fungal cultures (e.g., Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum, and Galerina marginata), or they can be made by expression of the encoding genes (obtained from the increasing number of microbial genome sequences) in hosts such as E. coli, Pichia pastoris, or a filamentous fungus such as T. reesei. Proteins can also be purified from commercial enzyme cocktails (e.g., Multifect Xylanase, Novozyme 188). An increasing number of pure enzymes, including glycosyl hydrolases, cell wall-active esterases, proteases, and lyases, are available from commercial sources, e.g., Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com), and PROZOMIX (www.prozomix.com).

Design-Expert software (Stat-Ease, Inc.) is used to create simplex-lattice designs and to analyze responses (in this case, Glc and Xyl release). Mixtures contain 4-20 components, which can vary in proportion between 0 and 100%. Assay points typically include the extreme vertices with a sufficient number of intervening points to generate a valid model. In the terminology of experimental design, most of our studies are “mixture” experiments, meaning that the sum of all components adds to a total fixed protein loading (expressed as mg/g glucan). The number of mixtures in the simplex-lattice depends on both the number of components in the mixture and the degree of polynomial (quadratic or cubic). For example, a 6-component experiment will entail 63 separate reactions with an augmented special cubic model, which can detect three-way interactions, whereas only 23 individual reactions are necessary with an augmented quadratic model. For mixtures containing more than eight components, a quadratic experimental design is more practical, and in our experience such models are usually statistically valid.

All enzyme loadings are expressed as a percentage of the final total loading (which for our experiments is typically 15 mg protein/g glucan). For “core” enzymes, the lower percentage limit is set to 5%. This limit was derived from our experience in which yields of Glc and/or Xyl were very low if any core enzyme was present at 0%. Poor models result from too many samples showing very low Glc or Xyl yields. Setting a lower limit in turn determines an upper limit. That is, for a six-component experiment, if the lower limit for each single component is set to 5%, then the upper limit of each single component will be 75%. The lower limits of all other enzymes considered as “accessory” are set to 0%. “Core” and “accessory” are somewhat arbitrary designations and will differ depending on the substrate, but in our studies the core enzymes for release of Glc from corn stover comprise the following enzymes from T. reesei: CBH1 (also known as Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1(Cel7B), BG (β-glucosidase), EX3 (endo-β1,4-xylanase, GH10), and BX (β-xylosidase).

Protocol

1. إنتاج إنزيم إنتاج البروتينات في pastoris Pichia عن طريق الاستنساخ من الجينات المقابلة في pPICZ نواقل أو pPICZα والتحول إلى P. pastoris. تنمو الخلايا الموجودة في 300 مل دفعات في قوارير 500 مل حيرة مع الحث الميثانول كل ساعة 24 (بانيرجي وآخرون ، 2010a). والتركيز على الرواشح desalt الثقافة عن طريق الترشيح تدفق عرضية. تخزين الأنزيمات في aliquots صغيرة في الجلسرين 20 ٪ عند -80 درجة مئوية. في نطاق التركيز هو 10-10 ملغ / مل. 2. تصميم التجربة إدخال عدد من الانزيمات لفحصها ، العلوي والسفلي النسب (على سبيل المثال نسبة أقل من 5 ٪ لالإنزيمات الأساسية) ، ونوع من التصميم التجريبي (على سبيل المثال ، من الدرجة الثانية أو مكعب) في Expertsoftware التصميم. المبلغ في حساب ميكروغرام لكل انزيم لتضاف إلى جعل تحميل مجموعه غلوكان مغ / ز 15 ، وثم حساب كمية الانزيم في كل ميكرولتر إضافة إلىكل رد فعل. إنشاء أوراق عمل Excel تحديد مصدر ابوار ، والآبار المصدر ، ابوار الوجهة ، الوجهة الآبار ، ونقل كميات من المياه للصرف والانزيمات وفقا لتصميم التجارب واستيراده في البرنامج FXP Biomek باستخدام وظيفة النقل ، من الملف. 3. الأنزيمية الحلمأة تعليق الطين الكتلة الحيوية في 50 ملي سيترات الصوديوم ، ودرجة الحموضة 4.8 ، التي تحتوي على 5 ميكروغرام / مل و 5 التتراسيكلين سيكلوهيكسيميد ميكروغرام / لتر ، في الخزان مجداف. آليا الماصة 200 ميكروليتر من الطين في كل بئر 96 – جيدا لوحات تفاعل عميق جيدا باستخدام سبان – 8 نصائح الماصة 1000 – ميكرولتر مع 0.5 سم مشاركة اقتطاع. خلط الطين مرة واحدة في 100 ميكرولتر / ثانية ، ونضح ثم نفس الحجم من الخزان مجداف والاستغناء في لوحات. الاستغناء عن الانزيمات في نفس الطبق باستخدام برنامج دخلت FX بيكمان. ختم لوحات مع capmats pierceable. عكس والاستفادةلوحات عدة مرات للتغلب على التوتر السطحي. وضع لوحات على 50 درجة مئوية لمدة 48 ساعة في التهجين حاضنة الدورية في 10 دورة في الدقيقة. 4. تحديد GLC وXyl الطرد المركزي لوحات رد فعل لمدة 3 دقائق في 1250 جهاز للطرد المركزي في XG الدلو المتأرجح. نقل 100 ميكروليتر من طاف في لوحات العادية 96 – جيدا باستخدام جراب AP96 من FX Biomek. احتضان لوحات في 90-95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة من أجل تعطيل الإنزيمات ، ومن ثم الطرد المركزي في 1250 x ج لمدة 30 ثانية. لقياسات GLC ، ونقل 12 ميكرولتر من supernatants في لوحات 96 – جيدا العادية. إضافة 192 ميكروليتر من كاشف الجلوكوز (GOPOD) أوكسيديز / البيروكسيداز. احتضان لوحات على 50 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة وقراءة absorbances بنحو 510 نانومتر في microplate القارئ. فارغ هو خليط التفاعل مع عدم وجود الانزيم. لقياسات Xyl ، ونقل 4 ميكروليتر إلى 384 جيدا لوحات. إضافة الكواشف فحص وقراءة لوحات بمبلغ 340 نانومتر. فارغةهي خليط التفاعل مع عدم وجود الانزيم. 5. تحليل البيانات تحويل القيم إلى الامتصاصية GLC ٪ وعائدات Xyl استنادا إلى GLC المعروفة وXyl مضمون الكتلة الأصلي. استيراد هذه النسب المئوية وردود في برنامج التصميم الخبراء. التحقق من paramenters الإحصائية للتأكد من أن يتم استيفاء المعايير لنموذج متين. تأكيد التنبؤ أفضل نموذج تجريبي. 6. ممثل النتائج مع GENPLAT : (1) خلق مزيج الأمثل للبروتينات نقية الفردية. وتشير النتائج التي إنزيمات مهمة ، في ما والنسب ، وكذلك الانزيمات التي ليست ذات أهمية. بعض البروتينات التي هي وفرة في T. reesei secretome (Nagendran وآخرون ، 2009) ، ومثل Cip1 Cip2 ، ويبدو أن تلعب أي دور في اطلاق سراح GLC من حطب الذرة سابقة التجهيز عن طريق التوسع الألياف الأمونيا (AFEX) أو القلوية HYD روجين بيروكسيد (برنامج مكافحة الجوع) (بانيرجي وآخرون ، 2010b). من ناحية أخرى ، وبعض البروتينات هامة بشكل غير متوقع. على سبيل المثال ، إندو – xylanases الأسر هيدرولاز غليكوزيل 10 و 11 وكلاهما مهم للافراج GLC ، واحد لا يمكن xylanase بديلا عن (ج بانيرجي وآخرون ، 2010b ،.) أخرى. Cel61A ، وهو بروتين صغير في T. reesei secretome ، مهم جدا ولكن ليس لGLC Xyl الافراج عنهم. بعض الأنزيمات الهامة لإطلاق سراح كل من GLC وXyl ، في حين أن البعض الآخر ضرورية فقط من أجل هذا أو ذاك (بانيرجي وآخرون ، 2010c). الإفراج عن خليط الاصطناعية تحتوي على مكونات 16 ، كل بتركيز 0.94 ملغم / لتر (أي خليط غير الأمثل) ، و 38 ٪ من GLC المتاحة من AFEX سابقة التجهيز ، نائب المدير العام. في ظل ظروف مماثلة المائي ، وهو مزيج أمثل ، والتي تراوحت تركيزات العناصر 16 من 0 ٪ إلى 32 ٪ ، أصدرت 52 ٪ من GLC (الشكل 2). هذه التجربة توضح فائدة بناء مخاليط محددة. _content "> (2) خلق من الكوكتيلات المعالجة الأمثل لمختلف / تركيبات الركيزة. الاستعدادات الحالية سلولاز تجارية هي" ذات حجم واحد يناسب الجميع "، وفي الواقع ، فإن أفضل الكوكتيل يعتمد على ركيزة كل والمعالجة و. منتج واحد مثل Accellerase 1000 يعطي غلة مختلفة من ركائز مختلفة سابقة التجهيز في الطريق نفسه ، وركيزة من تعرضوا لنفس المعالجة المسبقة مختلفة (الشكل 1) ، ونحن قد استخدمت لتحسين GENPLAT خليط من الانزيمات النقية لالمعالجة المسبقة المتعددة والمواد الأولية mutiple (بانيرجي وآخرون بن. ، 2010c). الشكل 2 يوضح كيف أن نسب انزيم الأمثل لل16 الانزيمات النقي يختلف عن حطب الذرة AFEX – سابقة التجهيز ، AHP سابقة التجهيز ، حطب الذرة ، ونائب المدير العام AFEX – سابقة التجهيز. ترد سوى 11 الانزيمات في الشكل 2 لأن الأمثل تم العثور على نسب الخمس الأخرى (Cel61B ، AbfB ، Cip1 ، Cip2 وCel12A) لتكون 0 ٪ (بانيرجي وآخرون ، 2010c). (3) رواية اكتشاف انزيم </strاونج>. بناء مخاليط الأمثل من البروتينات النقي هو عملية مستمرة. كما بروتينات جديدة تصبح متاحة في شكل نقي (من مصادر تجارية ، من خلال تعبير مغايرة ، أو عن طريق تنقية) ، يمكن اختبارها بشكل منتظم عن طريق إضافتها لضبط الأمثل الحالي. رواية البروتينات التي تساهم في GLC أو الإفراج Xyl ثم تصبح جزءا من مجموعة جديدة ومحسنة. بهذه الطريقة ، يصبح منبرا GENPLAT لتحديد إنزيمات جديدة لتفكيك الكتلة الحيوية. حققنا مقتطفات من الفطريات الأخرى من T. وألف reesei النيجر نمت على ركائز مختلفة. عززت واحد استخراج سيما GLC الغلة عندما تضاف إلى مجموعة أساسية لدينا. تمت تنقية هذا البروتين المسؤول ويظهر أن يكون هيدرولاز غليكوزيل الرواية غير موجودة في أي تحضير الانزيم التجارية (بانيرجي والتون ، ونتائج غير منشورة). (4) اكتشاف أفضل الانزيمات. بعد أن أظهرت GENPLAT مع الانزيمات التي هي أهم من التدهورالكتلة الحيوية بصفة خاصة ، لدينا فهم أفضل للأنزيمات التي يجب التركيز عليها لتحسينها. يمكن العثور على أمثلة أفضل من الانزيمات الهامة التي تبحث في الطبيعة أو التي الهندسة البروتين. (وهو الانزيم قد يكون "أفضل" من homolog لها reesei T. بطرق عدة ، اعتمادا على الخاصية المطلوبة ، على سبيل المثال انخفضت والنشاط العالي الخاصة ، وزيادة التآزر ، وحساسية بروتين ، أو تعزيز الاستقرار الحراري). GENPLAT يوفر منبرا مفيدا للمعايرة أنزيمات أفضل يحتمل ، لأنه يستخدم مزيج معقد واقعي (وهو أمر مهم لأنه لا يوجد أنزيم الكتلة الحيوية يعمل في عزلة) وركيزة (هام واقعية لأن النتائج مع السليلوز النقي أو ركائز اصطناعية أخرى قد لا تكون ذات صلة lignocellulosic الطبيعية المواد). (5) انزيم التحسين التجاري. كميات كبيرة بما فيه الكفاية من الانزيمات نقية لا وجود لها حتى الآن في العالم الحقيقي. حتى يفعلوا ، والإيثانول المواليةducers يجب الاعتماد على المنتجات التجارية مثل 1000 Accellerase وMultifectXylanase. ومع ذلك ، خليط من الانزيمات التجارية عموما أداء أفضل من أي فرد واحد ، ويمكن استخدامها لتصميم GENPLAT الكوكتيلات الأمثل من الانزيمات التجارية متعددة. الشكل 3 يبين استخدام GENPLAT لتحسين مزيج من أربعة استعدادات الانزيم التجارية. تم العثور على نسب مثالية لإطلاق سراح من GLC AFEX سابقة التجهيز ، نائب المدير العام لتكون 47 ٪ Accellerase1000 ، 27 ٪ Multifect بكتيناز ، و 22 ٪ Novozyme 188 ، و 4 ٪ Multifect Xylanase (بانيرجي وآخرون ، 2010c). ويبين الشكل 3B الاختلافات في المحصول من AFEX GLC – DDG مع استعدادات الانزيم الأربع ؛ الخليط الأمثل التجارية يعطي أعلى عائد من GLC Accellerase1000 وحده ، SpezymeCP وحده ، أو خليط مكون من 16 الاصطناعية. هذه التجربة يشير ايضا الى ان الخليط المكون من 16 الاصطناعية مفقود واحد أو أكثر من الانزيمات اللازمة لإطلاق سراح GLC الأمثل ، والتي هي موجودة في واحد أو أكثر من الإنزيمات التجارية. يمكن أن يكون لنا GENPLATإد لتحديد هذه المكونات. الشكل 1. رقم واحد تحضير الانزيم التجارية هو الأمثل لجميع ركائز والمعالجة المسبقة جميع. وتمت مقارنة خمس ركائز والمعالجة المسبقة الثلاثة تحت ظروف مماثلة لطحن (0.5 ملم حجم الجسيمات) ، انزيم التحميل (15 ملغ / غ جلوكان) ، وظروف التحلل (48 ساعة و 50 درجة مئوية). ألف الهضم من ركائز AFEX – سابقة التجهيز مختلفة مع Accellerase 1000. باء سابقة التجهيز الهضم من حطب الذرة بواسطة ثلاث طرق مختلفة مع Accellerase 1000 (انظر بانيرجي وآخرون ، 2010c). الشكل 2. نسب الأمثل للأنزيمات لإطلاق سراح 11 من GLC من AFEX سابقة التجهيز ، حطب الذرة (AFEX – CS) ، بيروكسيد الهيدروجين ، القلوية سابقة التجهيز حطب الذرة (AHP – CS) ، أو سابقة التجهيز ، AFEX المجففة تقطيرERS "الحبوب (AFEX – نائب المدير العام). البيانات هي من بانيرجي وآخرون. (2010c). أرقام على طول الجزء العلوي من القضبان هي غلة GLC كنسبة مئوية من مجموع GLC في العينة الكتلة الحيوية. الشكل 3 ألف. استخدام GENPLAT لانتاج أفضل مزيج من أربعة استعدادات الانزيم التجارية من أجل إطلاق سراح GLC من AFEX سابقة التجهيز ، نائب المدير العام. أدلى Multifect Xylanase أصغر مساهمة (4 ٪) ، وبالتالي حذفت من هذا المخطط الثلاثي. باء غلة GLC من AFEX – DDG مع علاجات مختلفة انزيم في ظل ظروف مماثلة المائي (15 انزيم غلوكان مغ / ز ، ح 48 ، و 50 درجة مئوية) . "المكون من أربعة التجارية" لديه النسب المحددة من التجربة هو مبين في الشكل. 3A.

Discussion

ومن المعترف به على نطاق واسع أن خفض تكلفة الانزيمات مهم لتطوير صناعة الايثانول lignocellulosic اقتصادية. المتاحة حاليا الكوكتيلات انزيم التجارية هي مزيج معقد ومحددة بشكل واضح من العديد من البروتينات (Nagendran وآخرون ، 2009) ، ويتم تكييفها أساسا للاستخدام على حمض سابقة التجهيز حطب الذرة. من أجل تسريع عملية تطوير أفضل الكوكتيلات الانزيم ، وضعت العديد من المختبرات عالية الإنتاجية منصات لاكتشاف انزيم والتوصيف. وقد أدرجت الجهود المبذولة في هذا المجال واحد أو أكثر من الخصائص التالية كما وجدت في GENPLAT : الاستغناء عن الروبوت من الانزيمات وعجائن الكتلة الحيوية ، والتصميم الإحصائي للتجربة ، و / أو تحديد الآلية لGLC وXyl (برلين وآخرون ، 2007 ؛ ديكر وآخرون. القاعدة ، 2009 ؛. كيم وآخرون ، 1998 ؛ الملك وآخرون ، 2009). GENPLAT تمتد هذه الجهود في وقت سابق ، وأهمها في تعقيد مخاليط الانزيم الذي يمكن تحليلها على الأكثر من 6 عناصر فيفي دراسات سابقة إلى أكثر من 16 في عمل آخر لدينا (بانيرجي وآخرون ، 2010c). الملامح الرئيسية إضافية من GENPLAT يتم استخدام غرفة خلط حبة (الخزان مجداف) التي يمكن أن تبقي عجائن حطب علقت خلال صرفها ؛ لطيف أثناء عملية الهضم خلط بحلول نهاية العام خلال نهاية التناوب ، وتحديد الآلية اللونية من حمض الغلوتاميك وXyl.

Materials

Equipments and software used:

1. Design–Expert software ,Version 8.0 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN) (http://www.statease.com)
2. Biomek FXP laboratory automation workstation (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
3. Biomek FXP software, Version 3.3 (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
4. Paddle reservoir (Model VP 756C-1P100, V & P Scientific Inc., San Diego)
5. Plates, 96-deep (1.5-ml) well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
6. Pierceable capmats (USA Scientific, Ocala, FL)
7. Rotating hybridization incubator (Model 5420,VWR)
8. Swinging-bucket centrifuge (Model 5810R, Eppendorf, Hamburg, Germany)
9. Plates, Costar 96-well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
10. Plates, 384-well (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA)

Reagents used:

1. Pichia pastoris and vectors: strain X33, and pPICZ and pPICZ_α (Invitrogen, Carlsbad, CA)
2. T. reesei and vectors: strain QM9414 (US Department of Agriculture National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, IL), and pCB1004-EV (Banerjee et al., 2010b)
3. Accellerase 1000 (lot number 1600844643) (Genencor, Inc., Rochester, NY)
4. 50 mM sodium citrate buffer, pH 4.8
5. Tetracycline stock: 10 mg/ml
6. Cycloheximide stock: 10 mg/ml
7. GOPOD assay kit , catalog K-GLUC (Megazyme, Bray, Ireland)
8. Xylose assay kit, catalog K-XYLOSE (Megazyme, Bray, Ireland)