GENPLAT: En automatiseret platform for biomasse Enzyme Discovery og Cocktail optimering

Summary

GENPLAT (GLBRC Enzyme Platform) er et automatiseret platform for opdagelse og optimering af enzym cocktails til biomasse nedbrydning. Det kan tilpasses til flere råmaterialer og blandinger af enzymer, som indeholder flere komponenter.

Abstract

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid transportation fuels such as ethanol. We have developed an integrated high throughput platform, called GENPLAT, for the discovery and development of novel enzymes and enzyme cocktails for the release of sugars from diverse pretreatment/biomass combinations. GENPLAT comprises four elements: individual pure enzymes, statistical design of experiments, robotic pipeting of biomass slurries and enzymes, and automated colorimeteric determination of released Glc and Xyl. Individual enzymes are produced by expression in Pichia pastoris or Trichoderma reesei, or by chromatographic purification from commercial cocktails or from extracts of novel microorganisms. Simplex lattice (fractional factorial) mixture models are designed using commercial Design of Experiment statistical software. Enzyme mixtures of high complexity are constructed using robotic pipeting into a 96-well format. The measurement of released Glc and Xyl is automated using enzyme-linked colorimetric assays. Optimized enzyme mixtures containing as many as 16 components have been tested on a variety of feedstock and pretreatment combinations.

GENPLAT is adaptable to mixtures of pure enzymes, mixtures of commercial products (e.g., Accellerase 1000 and Novozyme 188), extracts of novel microbes, or combinations thereof. To make and test mixtures of ˜10 pure enzymes requires less than 100 μg of each protein and fewer than 100 total reactions, when operated at a final total loading of 15 mg protein/g glucan. We use enzymes from several sources. Enzymes can be purified from natural sources such as fungal cultures (e.g., Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum, and Galerina marginata), or they can be made by expression of the encoding genes (obtained from the increasing number of microbial genome sequences) in hosts such as E. coli, Pichia pastoris, or a filamentous fungus such as T. reesei. Proteins can also be purified from commercial enzyme cocktails (e.g., Multifect Xylanase, Novozyme 188). An increasing number of pure enzymes, including glycosyl hydrolases, cell wall-active esterases, proteases, and lyases, are available from commercial sources, e.g., Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com), and PROZOMIX (www.prozomix.com).

Design-Expert software (Stat-Ease, Inc.) is used to create simplex-lattice designs and to analyze responses (in this case, Glc and Xyl release). Mixtures contain 4-20 components, which can vary in proportion between 0 and 100%. Assay points typically include the extreme vertices with a sufficient number of intervening points to generate a valid model. In the terminology of experimental design, most of our studies are “mixture” experiments, meaning that the sum of all components adds to a total fixed protein loading (expressed as mg/g glucan). The number of mixtures in the simplex-lattice depends on both the number of components in the mixture and the degree of polynomial (quadratic or cubic). For example, a 6-component experiment will entail 63 separate reactions with an augmented special cubic model, which can detect three-way interactions, whereas only 23 individual reactions are necessary with an augmented quadratic model. For mixtures containing more than eight components, a quadratic experimental design is more practical, and in our experience such models are usually statistically valid.

All enzyme loadings are expressed as a percentage of the final total loading (which for our experiments is typically 15 mg protein/g glucan). For “core” enzymes, the lower percentage limit is set to 5%. This limit was derived from our experience in which yields of Glc and/or Xyl were very low if any core enzyme was present at 0%. Poor models result from too many samples showing very low Glc or Xyl yields. Setting a lower limit in turn determines an upper limit. That is, for a six-component experiment, if the lower limit for each single component is set to 5%, then the upper limit of each single component will be 75%. The lower limits of all other enzymes considered as “accessory” are set to 0%. “Core” and “accessory” are somewhat arbitrary designations and will differ depending on the substrate, but in our studies the core enzymes for release of Glc from corn stover comprise the following enzymes from T. reesei: CBH1 (also known as Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1(Cel7B), BG (β-glucosidase), EX3 (endo-β1,4-xylanase, GH10), and BX (β-xylosidase).

Protocol

1. Enzymproduktion Producerer proteiner i Pichia pastoris ved kloning af de tilsvarende gener i vektorer pPICZ eller pPICZα og omdannelse til P. pastoris. Grow celler i 300-ml partier i forbløffet 500-ml kolber med methanol induktion hver 24 time (Banerjee et al., 2010a). Koncentrat og desalt kulturen Filtratet ved tangential flow filtrering. Opbevar enzymer i små mængder i 20% glycerol ved -80 ° C. Det koncentrationsområde er 1-10 mg / ml. 2. Design af eksperiment Input antallet af enzymer, der skal testes, deres øvre og lavere andel (fx en lavere andel på 5% for core enzymer), og typen af ​​eksperimentelle design (fx kvadratisk eller kubisk) i Design-Expertsoftware. Beregn mængden i mg hver enkelt enzym, der skal tilføjes at lave en samlet belastning på 15 mg / g glucan, og derefter beregne størrelsen af ​​den enkelte enzym i mikroliter med føje tilhver reaktion. Generer Excel-regneark med angivelse af kilde labware, kilde brønde, destination labware, destination brønde, og overføre mængder til dispensering af vand og enzymer i henhold til det eksperimentelle design og importere det til Biomek FXP software ved hjælp af transfer-fra-fil-funktionen. 3. Enzymatisk hydrolyse Hæng biomasse gyllen i 50 mM natriumcitrat, pH 4,8, indeholdende 5 mg / ml tetracyklin og 5 mg / ml cycloheximid i pagajen reservoiret. Robotersvejsede pipette 200 μl af gyllen i hvert hul paa en 96-brønds dyb-godt modholdsplader hjælp Span-8 1000-μl pipettespidser med de sidste 0,5 cm skåret af. Bland gyllen én gang på 100 μl / sek og derefter aspirér samme volumen fra pagajen reservoiret og dispensere ind i pladerne. Dispenser de enzymer i den samme plade ved hjælp af programmet indgik den af ​​Beckman FX. Forsegl plader med punktérbar capmats. Inverter, og trykpladerne flere gange for at overvinde overfladespænding. Placér pladerne ved 50 ° C i 48 HR i hybridisering inkubatoren roterende ved 10 rpm. 4. Bestemmelse af GLC og Xyl Centrifugér reaktionen plader i 3 min på 1250 xg i en svingende spand centrifuge. Overfør 100 μl af supernatanten til regulær 96-brønds plader med AP96 pod af Biomek FX. Pladerne inkuberes ved 90-95 ° C i 10 min for at inaktivere de enzymer, og derefter centrifugeres ved 1250 xg i 30 sek. For Glc målinger, overførsel 12 μl af supernatanter til regulær 96-brønds plader. Tilsæt 192 μl af glukose oxidase / peroxidase (GOPOD) reagens. Pladerne inkuberes ved 50 ° C i 20 min og læse absorbansværdi ved 510 nm i en mikrotiterplade læser. Blank er reaktionsblandingen uden enzym. For Xyl målinger, overførsel 4 μl i 384-godt plader. Tilsæt analysereagenserne og læse pladerne ved 340 nm. Blanker reaktionsblandingen uden enzym. 5. Dataanalyse Konverter absorbansen værdier til deres% Glc og Xyl renter baseret på den kendte Glc og Xyl indholdet af den oprindelige biomasse. Import disse procentsatser, som svarene i Design-Expert software. Kontroller statistiske paramenters at være sikker på, at kriterierne for en robust model er opfyldt. Bekræft den bedste model forudsigelse eksperimentelt. 6. Repræsentative resultater med GENPLAT: (1) Oprettelse af optimerede blandinger af individuelle rene proteiner. Resultaterne viser, hvilke enzymer er vigtige, og i hvilke proportioner, og også som enzymer er ikke vigtigt. Nogle proteiner, der er rigelige i T. reesei secretome (Nagendran et al., 2009), som f.eks Cip1 og Cip2, synes at spille nogen rolle i Glc løsladelse fra majshalm forbehandlet af ammoniak fiber ekspansion (AFEX) eller basisk Hyd Rogen peroxid (AHP) (Banerjee et al., 2010b). På den anden side er nogle proteiner uventet vigtig. For eksempel er endo-xylanases af glycosylphosphatidylinositolspecifikt hydrolase familier 10 og 11 begge er vigtige for Glc løslades; en xylanase kan ikke erstatte den anden (Banerjee et al, 2010b, c.). Cel61A, en mindre protein i T. reesei secretome, er meget vigtigt for Glc men ikke Xyl udgivelse. Nogle enzymer er vigtige for frigivelse af både Glc og Xyl, mens andre kun er nødvendigt til den ene eller den anden (Banerjee et al., 2010C). En syntetisk blanding, der indeholder 16 komponenter, hver i en koncentration på 0,94 mg / ml (dvs. en ikke-optimeret blanding), frigivet 38% af de tilgængelige Glc fra AFEX-forbehandlet DDG. Under identiske hydrolyse betingelser, en optimeret blanding, hvori koncentrationerne af de 16 komponenter varierede fra 0% til 32%, frigives 52% af Glc (fig. 2). Dette eksperiment illustrerer nytten af ​​konstruere definerede blandinger. _content "> (2) Oprettelse af optimeret cocktails til forskellige forbehandling / substrat kombinationer. Gængs cellulase præparater er" one-size-fits-all ". I virkeligheden, afhænger den bedste cocktail på både underlag og forbehandling. et enkelt produkt såsom Accellerase 1000 giver forskellige udbytter fra forskellige substrater forbehandlet på samme måde, og fra samme substrat udsat for forskellige forbehandlinger (fig. 1). Vi har brugt GENPLAT til at optimere blandinger af rene enzymer til flere forbehandlinger og multipel energiafgrøder (Banerjee et al., 2010C). Figur 2 viser, hvordan den optimale enzym proportioner af 16 rene enzymer er forskellig for AFEX-forbehandlet majshalm, AHP-forbehandlet majshalm, og AFEX-forbehandlet DDG. Kun 11 enzymer er vist i Fig. 2, fordi den optimale proportioner af de øvrige fem (Cel61B, AbfB, Cip1, Cip2, og Cel12A) blev anset for at være 0% (Banerjee et al., 2010C). (3) Nye enzym opdagelsen </strong>. Opførelsen af ​​optimerede blandinger af rene proteiner er en løbende proces. Efterhånden som nye proteiner bliver tilgængelige i ren form (fra kommercielle kilder, ved heterolog ekspression, eller ved rensning), kan de systematisk testet ved at tilføje dem til den aktuelle optimerede sæt. Nye proteiner, der bidrager til Glc eller Xyl frigive derefter bliver del af en ny, optimeret sæt. På denne måde bliver GENPLAT en platform til identifikation af nye enzymer til biomasse dekonstruktion. Vi har lavet ekstrakter af svampe andre end T. reesei og A. niger dyrket på forskellige substrater. En særlig ekstrakt forstærket Glc udbyttet, når tilføjet til vores kerne sæt. Den ansvarlige protein blev renset og vist sig at være en roman glycosylphosphatidylinositolspecifikt hydrolase ikke til stede i nogen form for kommerciel enzympræparat (Banerjee og Walton, upublicerede resultater). (4) Discovery af bedre enzymer. Have vist med GENPLAT hvilke enzymer er vigtigst for nedbrydning af enisær biomasse, vi har en bedre forståelse af, hvilke enzymer bør være i fokus for forbedringer. Bedre eksempler på den kritiske enzymer kunne findes ved at søge i naturen eller fremstillet af protein engineering. (Et enzym, kunne være "bedre" end sine T. reesei homolog på flere måder, afhængigt af den ønskede ejendom, f.eks højere specifik aktivitet, større synergi, nedsat proteolytisk følsomhed, eller forbedrede termiske stabilitet). GENPLAT giver en meningsfuld platform for analysering potentielt bedre enzymer, fordi det udnytter en realistisk kompleks cocktail (vigtigt, fordi ingen biomasse enzym virker i isolation) og en realistisk substrat (vigtige, fordi resultaterne med ren cellulose eller andre kunstige substrater ikke kan være relevante for naturlige træcellulose materialer). (5) Commercial enzym optimering. Tilstrækkeligt store mængder af ren enzymer endnu ikke eksisterer i den virkelige verden. Indtil de gør det, ethanol Producenter må stole på kommercielle produkter som Accellerase 1000 og MultifectXylanase. Men blandinger af kommercielle enzymer generelt klarer sig bedre end nogen enkelt en, og GENPLAT kan bruges til at designe optimerede cocktails af flere kommercielle enzymer. Figur 3 viser brugen af ​​GENPLAT til at optimere en blanding af fire kommercielle enzympræparater. Den optimale forhold for frigivelse af GLC fra AFEX-forbehandlet DDG blev fundet at være 47% Accellerase1000, 27% Multifect Pectinase, 22% Novozymes 188, og 4% Multifect Xylanase (Banerjee et al., 2010C). Figur 3B viser forskellene i Glc udbyttet fra AFEX-DDG med fire enzympræparater, den optimerede kommercielle blandingen giver højere Glc udbytte end Accellerase1000 alene, SpezymeCP alene, eller en 16-komponent syntetisk blanding. Dette eksperiment viser også, at den 16-komponent syntetisk blanding mangler et eller flere enzymer er nødvendige for optimal Glc udgivelse, som er til stede i en eller flere af de kommercielle enzymer. GENPLAT kan være osed at identificere sådanne komponenter. Figur 1. Ingen enkelt kommerciel enzympræparat er optimal for alle underlag og alle forbehandlinger. Fem substrater og tre forbehandlinger blev sammenlignet under samme betingelser for slibning (0,5 mm partikelstørrelse), enzym læsning (15 mg / g glucan), og hydrolyse betingelser (48 h, 50 ° C). A. fordøjelse af forskellige AFEX-forbehandlet underlag med Accellerase 1000. B. fordøjelsen af majshalm forbehandlet med tre forskellige metoder med Accellerase 1000 (se Banerjee et al., 2010C). Figur 2. Optimal proportioner af 11 enzymer til frigivelse af GLC fra AFEX-forbehandlet majshalm (AFEX-CS), alkalisk hydrogenperoxid-forbehandlet majshalm (AHP-CS), eller AFEX-forbehandlet tørret destilleregernes korn (AFEX-DDG). Data er fra Banerjee et al. (2010C). Tal langs toppen af ​​søjlerne er det Glc udbytte, som en procent af den samlede Glc i biomassen prøven. Figur 3. A. Brugen af GENPLAT til at producere en optimeret blanding af fire kommercielle enzympræparater for frigivelse af GLC fra AFEX-forbehandlet DDG. Multifect Xylanase gjort det mindste bidrag (4%) og blev derfor udeladt af denne ternær diagram. B. Glc udbyttet fra AFEX-DDG med forskellige enzym behandlinger under identiske hydrolyse betingelser (15 mg / g glucan enzym, 48 h, 50 ° C) . "Fire-komponent kommercielle" er proportionerne bestemt ud fra forsøget er vist i Fig. 3A.

Discussion

Det er almindeligt anerkendt, at reducere omkostningerne af enzymer er vigtig for udviklingen af ​​en økonomisk træcellulose ethanol industrien. I øjeblikket tilgængelige kommercielle enzym cocktails er komplekse og dårligt definerede blandinger af mange proteiner (Nagendran et al., 2009), og de er tilpasset primært til brug på syre-forbehandlet majsstængler. For at fremskynde udviklingen af ​​bedre enzym cocktails, har flere laboratorier udviklet high-throughput platforme for enzym opdagelse og karakterisering. Indsatsen på dette område har indarbejdet en eller flere af følgende egenskaber også findes i GENPLAT: robot udlevering af enzymer og biomasse slam, statistisk design af eksperiment, og / eller automatisk bestemmelse af GLC og Xyl (Berlin et al, 2007; Decker et. al, 2009;. Kim et al, 1998;. kong et al, 2009).. GENPLAT udvider disse tidligere indsats, mest markant i kompleksiteten af ​​enzymet blandinger, der kan analyseres ud fra højst 6 komponenter ide tidligere undersøgelser til mere end 16 i vores seneste arbejde (Banerjee et al., 2010C). Yderligere centrale elementer i GENPLAT er brugen af ​​en perle blandingskammer (paddle reservoir), der kan holde Stover slam suspenderet under dispensering, blid blanding under fordøjelsen ved udgangen-over-end rotation, og automatiserede kolorimetrisk bestemmelse af Glu og Xyl.

Materials

Equipments and software used:

1. Design–Expert software ,Version 8.0 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN) (http://www.statease.com)
2. Biomek FXP laboratory automation workstation (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
3. Biomek FXP software, Version 3.3 (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
4. Paddle reservoir (Model VP 756C-1P100, V & P Scientific Inc., San Diego)
5. Plates, 96-deep (1.5-ml) well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
6. Pierceable capmats (USA Scientific, Ocala, FL)
7. Rotating hybridization incubator (Model 5420,VWR)
8. Swinging-bucket centrifuge (Model 5810R, Eppendorf, Hamburg, Germany)
9. Plates, Costar 96-well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
10. Plates, 384-well (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA)

Reagents used:

1. Pichia pastoris and vectors: strain X33, and pPICZ and pPICZ_α (Invitrogen, Carlsbad, CA)
2. T. reesei and vectors: strain QM9414 (US Department of Agriculture National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, IL), and pCB1004-EV (Banerjee et al., 2010b)
3. Accellerase 1000 (lot number 1600844643) (Genencor, Inc., Rochester, NY)
4. 50 mM sodium citrate buffer, pH 4.8
5. Tetracycline stock: 10 mg/ml
6. Cycloheximide stock: 10 mg/ml
7. GOPOD assay kit , catalog K-GLUC (Megazyme, Bray, Ireland)
8. Xylose assay kit, catalog K-XYLOSE (Megazyme, Bray, Ireland)