GENPLAT: een geautomatiseerd platform voor biomassa Enzym Discovery en Cocktail Optimalisatie

Summary

GENPLAT (GLBRC Enzyme Platform) is een geautomatiseerd platform voor ontdekking en optimalisatie van het enzym cocktails voor biomassa degradatie. Het kan worden aangepast aan de verschillende grondstoffen en mengsels van enzymen met meerdere componenten.

Abstract

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid transportation fuels such as ethanol. We have developed an integrated high throughput platform, called GENPLAT, for the discovery and development of novel enzymes and enzyme cocktails for the release of sugars from diverse pretreatment/biomass combinations. GENPLAT comprises four elements: individual pure enzymes, statistical design of experiments, robotic pipeting of biomass slurries and enzymes, and automated colorimeteric determination of released Glc and Xyl. Individual enzymes are produced by expression in Pichia pastoris or Trichoderma reesei, or by chromatographic purification from commercial cocktails or from extracts of novel microorganisms. Simplex lattice (fractional factorial) mixture models are designed using commercial Design of Experiment statistical software. Enzyme mixtures of high complexity are constructed using robotic pipeting into a 96-well format. The measurement of released Glc and Xyl is automated using enzyme-linked colorimetric assays. Optimized enzyme mixtures containing as many as 16 components have been tested on a variety of feedstock and pretreatment combinations.

GENPLAT is adaptable to mixtures of pure enzymes, mixtures of commercial products (e.g., Accellerase 1000 and Novozyme 188), extracts of novel microbes, or combinations thereof. To make and test mixtures of ˜10 pure enzymes requires less than 100 μg of each protein and fewer than 100 total reactions, when operated at a final total loading of 15 mg protein/g glucan. We use enzymes from several sources. Enzymes can be purified from natural sources such as fungal cultures (e.g., Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum, and Galerina marginata), or they can be made by expression of the encoding genes (obtained from the increasing number of microbial genome sequences) in hosts such as E. coli, Pichia pastoris, or a filamentous fungus such as T. reesei. Proteins can also be purified from commercial enzyme cocktails (e.g., Multifect Xylanase, Novozyme 188). An increasing number of pure enzymes, including glycosyl hydrolases, cell wall-active esterases, proteases, and lyases, are available from commercial sources, e.g., Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com), and PROZOMIX (www.prozomix.com).

Design-Expert software (Stat-Ease, Inc.) is used to create simplex-lattice designs and to analyze responses (in this case, Glc and Xyl release). Mixtures contain 4-20 components, which can vary in proportion between 0 and 100%. Assay points typically include the extreme vertices with a sufficient number of intervening points to generate a valid model. In the terminology of experimental design, most of our studies are “mixture” experiments, meaning that the sum of all components adds to a total fixed protein loading (expressed as mg/g glucan). The number of mixtures in the simplex-lattice depends on both the number of components in the mixture and the degree of polynomial (quadratic or cubic). For example, a 6-component experiment will entail 63 separate reactions with an augmented special cubic model, which can detect three-way interactions, whereas only 23 individual reactions are necessary with an augmented quadratic model. For mixtures containing more than eight components, a quadratic experimental design is more practical, and in our experience such models are usually statistically valid.

All enzyme loadings are expressed as a percentage of the final total loading (which for our experiments is typically 15 mg protein/g glucan). For “core” enzymes, the lower percentage limit is set to 5%. This limit was derived from our experience in which yields of Glc and/or Xyl were very low if any core enzyme was present at 0%. Poor models result from too many samples showing very low Glc or Xyl yields. Setting a lower limit in turn determines an upper limit. That is, for a six-component experiment, if the lower limit for each single component is set to 5%, then the upper limit of each single component will be 75%. The lower limits of all other enzymes considered as “accessory” are set to 0%. “Core” and “accessory” are somewhat arbitrary designations and will differ depending on the substrate, but in our studies the core enzymes for release of Glc from corn stover comprise the following enzymes from T. reesei: CBH1 (also known as Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1(Cel7B), BG (β-glucosidase), EX3 (endo-β1,4-xylanase, GH10), and BX (β-xylosidase).

Protocol

1. Productie van enzymen Produceren eiwitten in Pichia pastoris door het klonen van de overeenkomstige genen in vectoren pPICZ of pPICZα en transformatie in de P. pastoris. Groeien cellen in batches van 300 ml in de war van 500 ml flesjes met methanol inductie per 24 uur (Banerjee et al.., 2010a). Concentreren en ontzouten de cultuur filtraten door tangentiële flow filtratie. Bewaar de enzymen in kleine porties in 20% glycerol bij -80 ° C. De concentratie range is 1-10 mg / ml. 2. Ontwerp van Experiment Voer het aantal enzymen te testen, hun bovenste en onderste proporties (bijvoorbeeld een lager percentage van 5% voor kern enzymen), en het type van de experimentele opzet (bijvoorbeeld kwadratisch of kubieke) in de Design-Expertsoftware. Bereken de hoeveelheid in ug van elk enzym worden toegevoegd aan een totale belasting van 15 mg / g glucan te maken, en dan berekenen het bedrag van elke enzym in ul toe te voegen aanelke reactie. Het genereren van Excel-werkbladen met vermelding van de bron laboratoriumartikelen, bron putten, bestemming laboratoriumartikelen, bestemming putten, en de overdracht volumes voor het doseren van water en enzymen op basis van de experimenteel ontwerp en importeren in het Biomek FXP software met behulp van de transfer-van-file functie. 3. Enzymatische hydrolyse Hang de biomassa slurry in 50 mM natriumcitraat, pH 4,8, met 5 ug / ml tetracycline en 5 ug / ml cycloheximide, in de peddel reservoir. Robot Pipetteer 200 ul van de slurry in elke well van een 96-wells deep-well platen reactie met behulp van Span-8 1000-il pipetpunten met de laatste 0,5 cm afgesneden. Zodra Meng de slurry op 100 ul / sec en dan zuig hetzelfde volume van de peddel reservoir en afzien in de platen. Doseer de enzymen in de dezelfde plaat met behulp van het programma ingevoerd in de Beckman FX. Afdichting van de platen met doorboren capmats. Omkeren en tik opde platen een paar keer aan de oppervlakte spanning te overwinnen. Plaats de platen bij 50 ° C gedurende 48 uur in de hybridisatie incubator roterende bij 10 toeren per minuut. 4. Bepaling van het GLC en XYL Centrifugeer de reactie platen gedurende 3 min bij 1250 xg in een swingende emmer centrifuge. Breng 100 ul van de bovenstaande vloeistof in de reguliere 96-wells platen met behulp van de AP96 pod van de Biomek FX. Incubeer de platen bij 90-95 ° C gedurende 10 min in om de enzymen te inactiveren, en dan centrifugeer bij 1250 xg gedurende 30 sec. Voor Glc metingen, overdracht 12 ul van de bovenstaande vloeistoffen in de reguliere 96-wells platen. Voeg 192 ul van de glucose-oxidase / peroxidase (GOPOD) reagens. Incubeer de platen bij 50 ° C gedurende 20 min en lees de absorptie bij 510 nm in een microplaat reader. Blank is reactiemengsel met geen enzym. Voor de XYL metingen, transfer 4 pl in 384-wells platen. Voeg de assay reagentia en lees de platen bij 340 nm. Blancowordt het reactiemengsel met geen enzym. 5. Data Analysis Zet de extinctiewaarden om hun% Glc en XYL rendementen op basis van de bekende GLC en XYL inhoud van de oorspronkelijke biomassa. Importeren deze percentages als de antwoorden in de Design-Expert software. Controleer de statistische parameters, om er zeker van dat de criteria voor een robuust model is voldaan. Experimenteel te bevestigen het beste model voorspelling. 6. Representatieve resultaten met GENPLAT: (1) Creatie van geoptimaliseerde mengsels van individuele pure eiwitten. De resultaten geven aan welke enzymen belangrijk zijn, en in welke verhouding, en ook welke enzymen zijn niet belangrijk. Sommige eiwitten die in overvloed zijn in de T. reesei secretoom (Nagendran et al.., 2009), zoals Cip1 en Cip2, lijken geen rol te spelen in Glc ontslag uit maïsstro voorbehandeld door ammoniak vezels expansie (AFEX) of alkalisch HYD Rogen peroxide (AHP) (Banerjee et al.., 2010b). Aan de andere kant, sommige eiwitten zijn belangrijk onverwacht. Bijvoorbeeld, endo-xylanasen van glycosyl hydrolase familie 10 en 11 zijn beide van belang voor Glc vrijlating; een xylanase kan geen vervanging zijn voor de andere (Banerjee et al., 2010b, c).. Cel61A, een klein eiwit in de T. reesei secretoom, is erg belangrijk voor Glc, maar niet XYL release. Sommige enzymen zijn belangrijk voor het vrijgeven van zowel GLC en XYL, terwijl andere zijn alleen nodig voor de ene of de andere (Banerjee et al.., 2010C). Een synthetisch mengsel dat 16 componenten, die elk bij een concentratie van 0,94 mg / ml (dwz een niet-geoptimaliseerde mengsel), vrij 38% van de beschikbare Glc van AFEX-voorbehandelde DDG. Onder identieke omstandigheden hydrolyse, een geoptimaliseerde mengsel, waarin de concentraties van de 16 componenten varieerden van 0% tot 32%, vrij 52% van de Glc (afb. 2). Dit experiment illustreert het nut van de bouw van gedefinieerde mengsels. _content "> (2) Creatie van cocktails geoptimaliseerd voor verschillende voorbehandeling / substraat combinaties. De huidige commerciële cellulase voorbereidingen zijn" one-size-fits-all ". In werkelijkheid is de beste cocktail is afhankelijk van zowel de ondergrond en de voorbehandeling. Een product zoals Accellerase 1000 geeft verschillende opbrengsten uit verschillende substraten voorbehandeld op dezelfde manier, en van hetzelfde substraat blootgesteld aan verschillende voorbehandelingen (fig. 1). We hebben GENPLAT gebruikt om mengsels van pure enzymen te optimaliseren voor meerdere voorbehandelingen en mutiple grondstoffen (Banerjee et Al., 2010C). Figuur 2 laat zien hoe de optimale enzym verhoudingen van 16 pure enzymen verschilt voor AFEX-voorbehandelde maïsstro, AHP-voorbehandelde maïsstro, en AFEX-voorbehandelde DDG. Slechts 11 enzymen worden getoond in Fig. twee, omdat de optimale proporties van de andere vijf (Cel61B, AbfB, Cip1, Cip2, en Cel12A) bleken 0% (Banerjee et al.., 2010C). (3) Nieuwe enzym ontdekking </strong>. De bouw van geoptimaliseerde mengsels van pure eiwitten is een continu proces. Als er nieuwe eiwitten beschikbaar in pure vorm (uit commerciële bronnen, door heterologe expressie, of door zuivering), kunnen ze systematisch worden getest door ze toe te voegen aan de huidige optimale set. Nieuwe eiwitten die bijdragen aan Glc of XYL vrijkomen worden dan deel van een nieuwe, geoptimaliseerde set. Op deze manier GENPLAT wordt een platform voor de identificatie van nieuwe enzymen voor biomassa deconstructie. We hebben extracten van schimmels andere dan de T. reesei en A. niger gekweekt op verschillende substraten. Een bijzonder extract versterkt Glc opleveren wanneer toegevoegd aan onze kern in te stellen. De verantwoordelijke eiwit werd gezuiverd en aangetoond dat het een roman glycosyl hydrolase niet aanwezig zijn in een commerciële enzympreparaat (Banerjee en Walton, niet gepubliceerde resultaten) zijn. (4) Ontdekking van een betere enzymen. Na afgebeeld met GENPLAT welke enzymen het belangrijkst zijn voor de afbraak van eenname biomassa, hebben we een beter begrip van die enzymen moet de focus voor verbetering. Betere voorbeelden van de kritieke enzymen kunnen worden gevonden door te zoeken in de natuur of door eiwit engineering. (Een enzym kan worden "beter" dan de T. reesei homoloog op verschillende manieren, afhankelijk van de gewenste eigenschap, bijvoorbeeld een hogere specifieke activiteit, meer synergie, verminderde proteolytische gevoeligheid of verbeterde thermische stabiliteit). GENPLAT levert een zinvolle platform voor het testen potentieel betere enzymen, omdat het gebruik maakt van een realistisch complexe cocktail (belangrijk omdat geen biomassa enzym werkt in isolatie) en een realistisch substraat (belangrijk omdat de resultaten met pure cellulose of andere kunstmatige substraten kunnen niet relevant zijn voor natuurlijke lignocellulose materialen). (5) Commerciële enzym optimalisatie. Voldoende grote hoeveelheden pure enzymen nog niet bestaan ​​in de echte wereld. Tot ze doen, ethanol proproducenten moeten vertrouwen op commerciële producten zoals Accellerase 1000 en MultifectXylanase. Echter, mengsels van commerciële enzymen over het algemeen beter presteren dan een individu een, en GENPLAT kan worden gebruikt om optimaal cocktails van verschillende commerciële enzymen te ontwerpen. Figuur 3 toont het gebruik van GENPLAT te optimaliseren een mengsel van vier commerciële enzympreparaten. De optimale verhouding voor het vrijgeven van Glc van AFEX-voorbehandeld DDG bleken 47% Accellerase1000, 27% Multifect Pectinase, 22% Novozyme 188, en 4% Multifect Xylanase (Banerjee et al.., 2010C) zijn. Figuur 3B toont de verschillen in Glc opbrengst van AFEX-DDG met vier enzympreparaten, de geoptimaliseerde commerciële mengsel geeft een hogere opbrengst dan Glc Accellerase1000 alleen, SpezymeCP alleen, of een 16-component synthetisch mengsel. Dit experiment geeft ook aan dat de 16-component synthetisch mengsel is van een of meer enzymen die nodig zijn voor een optimale Glc release, die aanwezig zijn in een of meer van de commerciële enzymen ontbreken. GENPLAT kunnen onsed van dergelijke componenten te identificeren. Figuur 1. Geen enkele commerciële enzympreparaat is optimaal voor alle ondergronden en alle voorbehandelingen. Vijf substraten en drie voorbehandelingen werden vergeleken onder vergelijkbare omstandigheden voor het malen van (0,5 mm korrelgrootte), enzym laden (15 mg / g glucan), en hydrolyse omstandigheden (48 uur, 50 ° C). A. Spijsvertering van verschillende AFEX voorbehandelde substraten met Accellerase 1000. B. Spijsvertering van maïsstro voorbehandeld door drie verschillende methoden met Accellerase 1000 (zie Banerjee et al.., 2010C). Figuur 2. Optimale verhoudingen van 11 enzymen voor de vrijgave van Glc van AFEX-voorbehandelde maïsstro (AFEX-CS), alkalische waterstofperoxide-voorbehandelde maïsstro (AHP-CS), of AFEX-voorbehandelde gedroogde destillerenERS 'korrels (AFEX-DDG). De gegevens zijn afkomstig Banerjee et al.. (2010C). Getallen langs de bovenkant van de balken zijn de Glc levert als een procent van de totale Glc in de biomassa monster. Figuur 3. A. Het gebruik van GENPLAT om een optimale mix van vier commerciële enzympreparaten voor het vrijgeven van Glc van AFEX-voorbehandelde DDG te produceren. Multifect xylanase maakte de kleinste bijdrage (4%) en is daarom weggelaten uit deze ternaire diagram. B. Glc opbrengsten van AFEX-DDG met verschillende enzym behandelingen onder identieke condities hydrolyse (15 mg / g glucan enzym, 48 h, 50 ° C) . "Vier-component commerciële" heeft de verhoudingen bepaald op basis van het experiment getoond in Fig. 3A.

Discussion

Het is algemeen erkend dat verlaging van de kosten van enzymen is belangrijk voor de ontwikkeling van een zuinige lignocellulose-ethanol industrie. Op dit moment beschikbare commerciële enzym cocktails zijn complex en slecht gedefinieerde mengsels van vele eiwitten (Nagendran et al.., 2009), en ze zijn aangepast vooral voor gebruik op zuur-voorbehandeld maïsstro. Om de ontwikkeling van betere enzym cocktails te versnellen, hebben verscheidene laboratoria ontwikkelde high-throughput platformen voor enzym ontdekking en karakterisering. Inspanningen op dit gebied hebben opgenomen van een of meer van de volgende eigenschappen ook gevonden in GENPLAT: robot afgifte van enzymen en biomassa slurries, statistische ontwerp van experiment, en / of geautomatiseerde bepaling van het GLC en XYL (Berlijn et al., 2007; Decker et. al., 2009;. Kim et al., 1998;. King et al., 2009).. GENPLAT breidt deze eerdere pogingen, wat het belangrijkst is in de complexiteit van het enzym mengsels kunnen worden geanalyseerd op de meeste zes componenten inde eerdere studies tot meer dan 16 in onze laatste werk (Banerjee et al.., 2010C). Extra belangrijkste kenmerken van GENPLAT zijn het gebruik van een kraal mengkamer (peddel reservoir) aan te kunnen houden Stover slurries opgeschort tijdens toevoer; voorzichtig mengen tijdens de spijsvertering door end-over-end rotation en geautomatiseerde colorimetrische bepaling van Glu en XYL.

Materials

Equipments and software used:

1. Design–Expert software ,Version 8.0 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN) (http://www.statease.com)
2. Biomek FXP laboratory automation workstation (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
3. Biomek FXP software, Version 3.3 (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
4. Paddle reservoir (Model VP 756C-1P100, V & P Scientific Inc., San Diego)
5. Plates, 96-deep (1.5-ml) well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
6. Pierceable capmats (USA Scientific, Ocala, FL)
7. Rotating hybridization incubator (Model 5420,VWR)
8. Swinging-bucket centrifuge (Model 5810R, Eppendorf, Hamburg, Germany)
9. Plates, Costar 96-well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
10. Plates, 384-well (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA)

Reagents used:

1. Pichia pastoris and vectors: strain X33, and pPICZ and pPICZ_α (Invitrogen, Carlsbad, CA)
2. T. reesei and vectors: strain QM9414 (US Department of Agriculture National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, IL), and pCB1004-EV (Banerjee et al., 2010b)
3. Accellerase 1000 (lot number 1600844643) (Genencor, Inc., Rochester, NY)
4. 50 mM sodium citrate buffer, pH 4.8
5. Tetracycline stock: 10 mg/ml
6. Cycloheximide stock: 10 mg/ml
7. GOPOD assay kit , catalog K-GLUC (Megazyme, Bray, Ireland)
8. Xylose assay kit, catalog K-XYLOSE (Megazyme, Bray, Ireland)