GENPLAT: una plataforma automatizada para el descubrimiento de enzimas de la biomasa y la optimización Cocktail

Summary

GENPLAT (Plataforma GLBRC la enzima) es una plataforma automatizada para el descubrimiento y optimización de los cócteles de enzimas para la degradación de la biomasa. Se puede adaptar a las materias primas y varias mezclas de enzimas que contienen múltiples componentes.

Abstract

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid transportation fuels such as ethanol. We have developed an integrated high throughput platform, called GENPLAT, for the discovery and development of novel enzymes and enzyme cocktails for the release of sugars from diverse pretreatment/biomass combinations. GENPLAT comprises four elements: individual pure enzymes, statistical design of experiments, robotic pipeting of biomass slurries and enzymes, and automated colorimeteric determination of released Glc and Xyl. Individual enzymes are produced by expression in Pichia pastoris or Trichoderma reesei, or by chromatographic purification from commercial cocktails or from extracts of novel microorganisms. Simplex lattice (fractional factorial) mixture models are designed using commercial Design of Experiment statistical software. Enzyme mixtures of high complexity are constructed using robotic pipeting into a 96-well format. The measurement of released Glc and Xyl is automated using enzyme-linked colorimetric assays. Optimized enzyme mixtures containing as many as 16 components have been tested on a variety of feedstock and pretreatment combinations.

GENPLAT is adaptable to mixtures of pure enzymes, mixtures of commercial products (e.g., Accellerase 1000 and Novozyme 188), extracts of novel microbes, or combinations thereof. To make and test mixtures of ˜10 pure enzymes requires less than 100 μg of each protein and fewer than 100 total reactions, when operated at a final total loading of 15 mg protein/g glucan. We use enzymes from several sources. Enzymes can be purified from natural sources such as fungal cultures (e.g., Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum, and Galerina marginata), or they can be made by expression of the encoding genes (obtained from the increasing number of microbial genome sequences) in hosts such as E. coli, Pichia pastoris, or a filamentous fungus such as T. reesei. Proteins can also be purified from commercial enzyme cocktails (e.g., Multifect Xylanase, Novozyme 188). An increasing number of pure enzymes, including glycosyl hydrolases, cell wall-active esterases, proteases, and lyases, are available from commercial sources, e.g., Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com), and PROZOMIX (www.prozomix.com).

Design-Expert software (Stat-Ease, Inc.) is used to create simplex-lattice designs and to analyze responses (in this case, Glc and Xyl release). Mixtures contain 4-20 components, which can vary in proportion between 0 and 100%. Assay points typically include the extreme vertices with a sufficient number of intervening points to generate a valid model. In the terminology of experimental design, most of our studies are “mixture” experiments, meaning that the sum of all components adds to a total fixed protein loading (expressed as mg/g glucan). The number of mixtures in the simplex-lattice depends on both the number of components in the mixture and the degree of polynomial (quadratic or cubic). For example, a 6-component experiment will entail 63 separate reactions with an augmented special cubic model, which can detect three-way interactions, whereas only 23 individual reactions are necessary with an augmented quadratic model. For mixtures containing more than eight components, a quadratic experimental design is more practical, and in our experience such models are usually statistically valid.

All enzyme loadings are expressed as a percentage of the final total loading (which for our experiments is typically 15 mg protein/g glucan). For “core” enzymes, the lower percentage limit is set to 5%. This limit was derived from our experience in which yields of Glc and/or Xyl were very low if any core enzyme was present at 0%. Poor models result from too many samples showing very low Glc or Xyl yields. Setting a lower limit in turn determines an upper limit. That is, for a six-component experiment, if the lower limit for each single component is set to 5%, then the upper limit of each single component will be 75%. The lower limits of all other enzymes considered as “accessory” are set to 0%. “Core” and “accessory” are somewhat arbitrary designations and will differ depending on the substrate, but in our studies the core enzymes for release of Glc from corn stover comprise the following enzymes from T. reesei: CBH1 (also known as Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1(Cel7B), BG (β-glucosidase), EX3 (endo-β1,4-xylanase, GH10), and BX (β-xylosidase).

Protocol

1. Producción de enzimas La producción de proteínas en Pichia pastoris mediante la clonación de los genes correspondientes en vectores pPICZ o pPICZα y su transformación en P. pastoris. Se cultivan las células en 300 ml en lotes desconcertado matraces de 500 ml con la inducción de metanol cada 24 horas (Banerjee et al., 2010a). Concentrar y desalinizar los filtrados del cultivo por filtración de flujo tangencial. Tienda de las enzimas en pequeñas alícuotas de 20% de glicerol a -80 ° C. El rango de concentración es 1.10 mg / ml. 2. Diseño del Experimento Introduzca el número de enzimas para la prueba, su superior e inferior de proporciones (por ejemplo, una menor proporción de 5% para las enzimas del núcleo), y el tipo de diseño experimental (por ejemplo, cuadrática o cúbica) en el diseño Expertsoftware. Calcular la cantidad en mg de cada enzima que se añade a hacer una carga total de 15 mg / g glucano, y después calcular la cantidad de cada enzima en l que añadir acada reacción. Generar hojas de cálculo Excel especificando material de laboratorio de origen, los pozos de la fuente, material de laboratorio de destino, los pozos de destino, y los volúmenes de transferencia para la distribución de agua y las enzimas de acuerdo con el diseño experimental y la importación en el software Biomek FXP utilizando la función de transferencia-de-archivo. 3. La hidrólisis enzimática Suspender la suspensión de la biomasa en 50 mM de citrato sódico, pH 4,8, que contiene 5 mg / ml de tetraciclina y 5 cicloheximida mg / ml, en el embalse de paddle. Robot pipeta 200 ul de la mezcla en cada pocillo de una placas de 96 pocillos de reacción de pozo profundo con Span-8 1000-l puntas de pipeta con los últimos 0,5 cm cortado. Mezclar la pasta una vez a 100 l / seg y luego aspirar el mismo volumen de la reserva paddle y se distribuye en las placas. Prescindir de las enzimas en el mismo plato con el programa entró en el FX Beckman. Sellar las placas con capmats perforables. Invertir y toquelas placas en varias ocasiones para superar la tensión superficial. Coloque las placas a 50 ° C durante 48 horas en la hibridación incubadora girando a 10 rpm. 4. Determinación de la Glc y XYL Centrifugar las placas de reacción durante 3 minutos a 1250 xg en una centrífuga de basculante. Transferencia de 100 l del sobrenadante en regulares placas de 96 pocillos con la vaina de la AP96 FX Biomek. Las placas se incuban a 90-95 ° C durante 10 minutos para inactivar las enzimas, y luego se centrifuga a 1250 xg durante 30 segundos. Para las mediciones de Glc, la transferencia de 12 l de los sobrenadantes en regulares placas de 96 pocillos. Añadir 192 l de la glucosa oxidasa / peroxidasa (goPod) reactivo. Las placas se incuban a 50 ° C durante 20 minutos y leer las absorbancias a 510 nm en un lector de microplacas. En blanco se mezcla de reacción sin enzima. Para las mediciones de XYL, la transferencia de 4 l en placas de 384 pocillos. Añadir los reactivos de ensayo y leer las placas a 340 nm. En blancoes la mezcla de reacción sin enzima. 5. Análisis de Datos Convertir los valores de absorbancia a su Glc% y los rendimientos XYL basada en el conocido Glc y contenido XYL de la biomasa original. Importación de estos porcentajes, las respuestas en el software Design-Expert. Compruebe la paramenters estadísticos para asegurarse de que los criterios para un modelo sólido que se cumplan. Confirman la predicción mejor modelo experimental. 6. Los resultados representativos con GENPLAT: (1) Creación de mezclas optimizadas de cada uno de proteínas puras. Los resultados indican que las enzimas son importantes, y en qué proporciones, y también que las enzimas no son importantes. Algunas proteínas que son abundantes en la T. reesei secretoma (Nagendran et al., 2009), como Cip1 y CIP2, parecen desempeñar ningún papel en la liberación del maíz Glc pretratados por la expansión de fibra amoniaco (AFEX) o alcalino hyd rastrojo Rogen peróxido (AHP) (Banerjee et al., 2010b). Por otro lado, algunas proteínas son inesperadamente importante. Por ejemplo, endo-xilanasas de las familias de glicosil hidrolasa 10 y 11 son importantes para la liberación Glc, una xilanasa no puede sustituir a la otra (Banerjee et al, 2010b, c).. Cel61A, una proteína de menor importancia en la T. reesei secretoma, es muy importante para Glc pero no XYL liberación. Algunas enzimas son importantes para la liberación de ambos Glc y XYL, mientras que otros sólo son necesarios para uno u otro (Banerjee et al., 2010c). Una mezcla sintética que contiene 16 componentes, cada uno a una concentración de 0,94 mg / ml (es decir, una mezcla no optimizado), lanzado el 38% de la disponible Glc de AFEX pretratados DDG. En condiciones de hidrólisis idénticas, una mezcla optimizada, en la que las concentraciones de los 16 componentes del 0% al 32%, dado a conocer el 52% de la Glc (Fig. 2). Este experimento ilustra la utilidad de la construcción de mezclas definidas. _content "> (2) Creación de un cóctel optimizado para el pretratamiento diferentes / combinaciones de sustrato. actuales preparaciones de celulasa comerciales son de" talla única para todos ". En realidad, el mejor cóctel depende del sustrato y el pretratamiento. Un solo producto como Accellerase 1000 ofrece diferentes rendimientos de los diferentes sustratos tratados previamente de la misma manera, y desde el mismo sustrato expuestos a diferentes tratamientos previos (Fig. 1). Hemos utilizado GENPLAT para optimizar las mezclas de enzimas puras para múltiples tratamientos previos y materias primas mutiple (Banerjee et al., 2010c). Figura 2 muestra cómo la proporción óptima de la enzima de 16 enzimas puras es diferente para el rastrojo de maíz AFEX pretratados, AHP pretratados rastrojo de maíz y DDG AFEX pretratados. Sólo el 11 por enzimas se muestra en la Fig. 2. porque el óptimo proporciones de los otros cinco (Cel61B, AbfB, Cip1, CIP2 y Cel12A) resultaron ser del 0% (Banerjee et al., 2010c). (3) Nuevos descubrimiento de enzimas </strong>. La construcción de mezclas optimizadas de proteínas puras es un proceso continuo. Como las proteínas se dispone de nuevas en su forma pura (a partir de fuentes comerciales, por la expresión heteróloga, o por la purificación), pueden ser sometidas a ensayos mediante su inclusión en el conjunto optimizado actual. Nuevas proteínas que contribuyen a la liberación Glc o XYL pasan a formar parte de una nueva y optimizada. De esta manera, GENPLAT convierte en una plataforma para la identificación de nuevas enzimas para la deconstrucción de la biomasa. Hemos hecho los extractos de otros hongos que T. reesei y A. niger cultivado en diferentes sustratos. Un extracto especial impulsado Glc rendimiento cuando se añade a nuestra colección básica. La proteína responsable fue purificado y ha demostrado ser una hidrolasa novela glicosil no están presentes en cualquier preparado enzimático comercial (Banerjee y Walton, resultados no publicados). (4) El descubrimiento de mejores enzimas. Después de haber demostrado con GENPLAT que las enzimas son más importantes para la degradación de unbiomasa en particular, tenemos una mejor comprensión de las enzimas que debe ser el enfoque de mejora. Mejores ejemplos de las enzimas críticas se puede encontrar buscando en la naturaleza o fabricados por ingeniería de proteínas. (Una enzima podría ser "mejor" que su homólogo de T. reesei de varias maneras, dependiendo de la propiedad deseada, por ejemplo, actividad específica más alta, una mayor sinergia, disminución de la sensibilidad proteolítica, o la estabilidad térmica mejorada). GENPLAT ofrece una plataforma significativa para el ensayo de enzimas potencialmente mejor, ya que utiliza un cóctel complejo realista (importante porque no enzimática de biomasa funciona en forma aislada) y un sustrato realista (importante porque los resultados con pura celulosa u otros sustratos artificiales pueden no ser relevantes para lignocelulósicos naturales materiales). (5) la optimización de enzimas comerciales. Cantidades suficientes de enzimas puras no existen en el mundo real. Hasta que lo hagan, el etanol prolos productores deben confiar en los productos comerciales, tales como Accellerase 1000 y MultifectXylanase. Sin embargo, las mezclas de enzimas comerciales funcionan mejor que cualquier individuo, y GENPLAT se puede utilizar para el diseño optimizado de múltiples cócteles de enzimas comerciales. La Figura 3 muestra el uso de GENPLAT para optimizar una mezcla de cuatro preparados enzimáticos comerciales. Las proporciones óptimas para la liberación de Glc de AFEX pretratados DDG se encontró que el 47% Accellerase1000, el 27% Multifect pectinasa, el 22% Novozyme 188, y el 4% Multifect xilanasa (Banerjee et al., 2010c). Figura 3B muestra las diferencias en el rendimiento de AFEX Glc-DDG con cuatro preparados enzimáticos, la mezcla comercial optimizado ofrece un mayor rendimiento de Glc Accellerase1000 solo, SpezymeCP solo, o una mezcla sintética de 16 componentes. Esta experiencia también indica que la mezcla sintética de 16 componentes que falta uno o más enzimas necesarias para la óptima liberación Glc, que están presentes en uno o más de las enzimas comerciales. GENPLAT puede sered para identificar estos componentes. Figura 1. No solo la preparación enzimática comercial es óptimo para todos los sustratos y pretratamientos todos. Cinco sustratos y tratamientos previos tres se compararon en las mismas condiciones de la molienda (0,5 mm de tamaño de partícula), la carga de la enzima (15 mg / g glucano), y las condiciones de hidrólisis (48 h, 50 ° C). A. La digestión de los diferentes sustratos pretratados AFEX con Accellerase 1000. digestión B. de rastrojo de maíz pretratadas con tres métodos diferentes con Accellerase 1000 (ver Banerjee et al., 2010c). Figura 2. Proporciones óptimas de 11 enzimas para la liberación de Glc de AFEX pretratados con el rastrojo de maíz (AFEX-CS), alcalinas de peróxido de hidrógeno pretratados con el rastrojo de maíz (AHP-CS), o AFEX pretratados secos destilargranos de res "(AFEX-DDG). Los datos proceden de Banerjee et al. (2010c). Números en la parte superior de las barras son los rendimientos Glc como un porcentaje del total de Glc en la muestra de la biomasa. Figura 3. A. El uso de GENPLAT para producir una mezcla optimizada de los cuatro preparados enzimáticos comerciales para la liberación de Glc de AFEX pretratados DDG. Multifect xilanasa hecho la contribución más pequeña (4%) y por lo tanto, se omitió en este diagrama ternario. Glc B. rendimientos de AFEX-DDG con tratamientos de enzimas diferentes en condiciones de hidrólisis idénticos (15 mg / g enzima glucano, 48 h, 50 ° C) . "Cuatro componentes comerciales" tiene las proporciones determinadas a partir del experimento se muestra en la fig. 3A.

Discussion

Es ampliamente reconocido que la reducción del costo de las enzimas es importante para el desarrollo de una industria de etanol lignocelulósico económica. Cócteles comerciales disponibles en la actualidad las enzimas son mezclas complejas y mal definido de muchas proteínas (Nagendran et al., 2009), y están adaptados principalmente para el uso de ácido pretratados con el rastrojo de maíz. Con el fin de acelerar el desarrollo de un cóctel de enzimas mejor, varios laboratorios han desarrollado plataformas de alto rendimiento para el descubrimiento y caracterización de enzimas. Los esfuerzos en esta área han incorporado uno o más de las siguientes propiedades también se encuentra en GENPLAT: robot de dispensación de las enzimas y lodos de la biomasa, el diseño estadístico de experimentos, y / o determinación automática de Glc y XYL (Berlin et al, 2007; Decker et. al, 2009;. Kim et al, 1998;. King et al, 2009).. GENPLAT extiende estos primeros esfuerzos, lo más importante en la complejidad de las mezclas de enzimas que pueden ser analizados desde un máximo de 6 componentes enlos estudios anteriores de más de 16 años en nuestros últimos trabajos (Banerjee et al., 2010c). Otras funciones clave de GENPLAT son el uso de una cámara de mezcla de bolas (depósito de remo) que puede mantener el rastrojo lodos suspendidos durante la distribución, mezcla suave durante la digestión de extremo a extremo de rotación, y la determinación colorimétrica automatizado de Glu y XYL.

Materials

Equipments and software used:

1. Design–Expert software ,Version 8.0 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN) (http://www.statease.com)
2. Biomek FXP laboratory automation workstation (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
3. Biomek FXP software, Version 3.3 (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
4. Paddle reservoir (Model VP 756C-1P100, V & P Scientific Inc., San Diego)
5. Plates, 96-deep (1.5-ml) well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
6. Pierceable capmats (USA Scientific, Ocala, FL)
7. Rotating hybridization incubator (Model 5420,VWR)
8. Swinging-bucket centrifuge (Model 5810R, Eppendorf, Hamburg, Germany)
9. Plates, Costar 96-well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
10. Plates, 384-well (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA)

Reagents used:

1. Pichia pastoris and vectors: strain X33, and pPICZ and pPICZ_α (Invitrogen, Carlsbad, CA)
2. T. reesei and vectors: strain QM9414 (US Department of Agriculture National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, IL), and pCB1004-EV (Banerjee et al., 2010b)
3. Accellerase 1000 (lot number 1600844643) (Genencor, Inc., Rochester, NY)
4. 50 mM sodium citrate buffer, pH 4.8
5. Tetracycline stock: 10 mg/ml
6. Cycloheximide stock: 10 mg/ml
7. GOPOD assay kit , catalog K-GLUC (Megazyme, Bray, Ireland)
8. Xylose assay kit, catalog K-XYLOSE (Megazyme, Bray, Ireland)