GENPLAT: en automatiserad plattform för biomassa Enzyme Discovery och Cocktail optimering

Summary

GENPLAT (GLBRC Enzyme Platform) är en automatiserad plattform för upptäckt och optimering av enzym cocktails för biomassa nedbrytning. Det kan anpassas till flera olika råvaror och blandningar av enzymer som innehåller flera komponenter.

Abstract

The high cost of enzymes for biomass deconstruction is a major impediment to the economic conversion of lignocellulosic feedstocks to liquid transportation fuels such as ethanol. We have developed an integrated high throughput platform, called GENPLAT, for the discovery and development of novel enzymes and enzyme cocktails for the release of sugars from diverse pretreatment/biomass combinations. GENPLAT comprises four elements: individual pure enzymes, statistical design of experiments, robotic pipeting of biomass slurries and enzymes, and automated colorimeteric determination of released Glc and Xyl. Individual enzymes are produced by expression in Pichia pastoris or Trichoderma reesei, or by chromatographic purification from commercial cocktails or from extracts of novel microorganisms. Simplex lattice (fractional factorial) mixture models are designed using commercial Design of Experiment statistical software. Enzyme mixtures of high complexity are constructed using robotic pipeting into a 96-well format. The measurement of released Glc and Xyl is automated using enzyme-linked colorimetric assays. Optimized enzyme mixtures containing as many as 16 components have been tested on a variety of feedstock and pretreatment combinations.

GENPLAT is adaptable to mixtures of pure enzymes, mixtures of commercial products (e.g., Accellerase 1000 and Novozyme 188), extracts of novel microbes, or combinations thereof. To make and test mixtures of ˜10 pure enzymes requires less than 100 μg of each protein and fewer than 100 total reactions, when operated at a final total loading of 15 mg protein/g glucan. We use enzymes from several sources. Enzymes can be purified from natural sources such as fungal cultures (e.g., Aspergillus niger, Cochliobolus carbonum, and Galerina marginata), or they can be made by expression of the encoding genes (obtained from the increasing number of microbial genome sequences) in hosts such as E. coli, Pichia pastoris, or a filamentous fungus such as T. reesei. Proteins can also be purified from commercial enzyme cocktails (e.g., Multifect Xylanase, Novozyme 188). An increasing number of pure enzymes, including glycosyl hydrolases, cell wall-active esterases, proteases, and lyases, are available from commercial sources, e.g., Megazyme, Inc. (www.megazyme.com), NZYTech (www.nzytech.com), and PROZOMIX (www.prozomix.com).

Design-Expert software (Stat-Ease, Inc.) is used to create simplex-lattice designs and to analyze responses (in this case, Glc and Xyl release). Mixtures contain 4-20 components, which can vary in proportion between 0 and 100%. Assay points typically include the extreme vertices with a sufficient number of intervening points to generate a valid model. In the terminology of experimental design, most of our studies are “mixture” experiments, meaning that the sum of all components adds to a total fixed protein loading (expressed as mg/g glucan). The number of mixtures in the simplex-lattice depends on both the number of components in the mixture and the degree of polynomial (quadratic or cubic). For example, a 6-component experiment will entail 63 separate reactions with an augmented special cubic model, which can detect three-way interactions, whereas only 23 individual reactions are necessary with an augmented quadratic model. For mixtures containing more than eight components, a quadratic experimental design is more practical, and in our experience such models are usually statistically valid.

All enzyme loadings are expressed as a percentage of the final total loading (which for our experiments is typically 15 mg protein/g glucan). For “core” enzymes, the lower percentage limit is set to 5%. This limit was derived from our experience in which yields of Glc and/or Xyl were very low if any core enzyme was present at 0%. Poor models result from too many samples showing very low Glc or Xyl yields. Setting a lower limit in turn determines an upper limit. That is, for a six-component experiment, if the lower limit for each single component is set to 5%, then the upper limit of each single component will be 75%. The lower limits of all other enzymes considered as “accessory” are set to 0%. “Core” and “accessory” are somewhat arbitrary designations and will differ depending on the substrate, but in our studies the core enzymes for release of Glc from corn stover comprise the following enzymes from T. reesei: CBH1 (also known as Cel7A), CBH2 (Cel6A), EG1(Cel7B), BG (β-glucosidase), EX3 (endo-β1,4-xylanase, GH10), and BX (β-xylosidase).

Protocol

1. Enzymproduktion Producera proteiner i Pichia pastoris genom kloning av motsvarande gener i vektorer pPICZ eller pPICZα och omvandling till P. pastoris. Väx celler i 300 ml-partier i förbryllade 500 ml-flaskor med metanol induktion var 24 h (Banerjee et al. 2010a). Koncentrera och AVSALTA kulturen filtraten med tangentiell flow filtration. Förvara enzymerna i små portioner i 20% glycerol vid -80 ° C. Koncentrationen Räckvidden är 1-10 mg / ml. 2. Design av experiment Mata in antal enzymer som ska testas, deras övre och nedre proportioner (t.ex. en lägre andel på 5% för kärnan enzymer), och vilken typ av experimentell design (t.ex. kvadratisk eller kubisk) i Design-Expertsoftware. Beräkna mängden i ìg varje enzym som ska läggas för att göra en total belastning på 15 mg / g glukan, och sedan beräkna beloppet för varje enzym i l att lägga tillvarje reaktion. Skapa Excel-kalkylblad ange källa laboratorieutrustning, brunnar källan, målet laboratorieutrustning, brunnar destination, och volymer överföring för dosering av vatten och enzymer i enlighet med experimentell design och importera den till Biomek FXP programvara med överföring-från-fil funktion. 3. Enzymatisk hydrolys Häng biomassa gödseln i 50 mm natriumcitrat, pH 4,8, som innehåller 5 mikrogram / ml tetracyklin och 5 mikrogram / ml cykloheximid i paddeln reservoaren. Robotsvetsad Pipettera 200 l av slam i varje brunn på en 96-väl djupa brunnar reaktionen plattor med Span-8 1000-l pipettera tips med de senaste 0,5 cm avskuren. Blanda slammet gång på 100 l / sek och sedan aspirera samma volym från paddeln reservoaren och fördela i tallrikar. Fördela de enzymer i samma tallrik använda programmet in i Beckman FX. Täta plattorna med perforerbara capmats. Invertera och knackaplattorna flera gånger för att övervinna ytspänning. Placera plattorna vid 50 ° C under 48 h på hybridisering inkubatorn roterar med 10 rpm. 4. Fastställande av Glc och XYL Centrifugera reaktionen plattorna i 3 min vid 1250 xg i en svängig hink centrifug. Överför 100 ìl av supernatanten i vanliga 96-brunnar med AP96 pod av Biomek FX. Inkubera plattorna vid 90-95 ° C i 10 min för att inaktivera enzymer, och sedan centrifugera vid 1250 xg under 30 sek. För Glc mätningar, överföring 12 ìl av supernatanterna till reguljär plattor med 96 brunnar. Tillsätt 192 ìl av glukos oxidas / peroxidas (GOPOD) reagens. Inkubera plattorna vid 50 ° C i 20 minuter och läs absorbanserna vid 510 nm i en mikroplattor läsare. Blank är reaktionsblandningen utan enzym. För XYL mätningar, överför 4 l till 384-hålsplattor. Tillsätt analysreagenser och läs plattorna vid 340 nm. Blankär reaktionsblandningen utan enzym. 5. Dataanalys Konvertera absorbansvärdena till deras% Glc och XYL avkastningen baseras på de kända Glc och XYL innehållet i den ursprungliga biomassan. Importera dessa procentsatser eftersom svaren i Design-Expert mjukvara. Kontrollera statistiska paramenters att vara säker på att kriterierna för en robust modell är uppfyllda. Bekräfta den bästa modellen förutsägelse experimentellt. 6. Representativa resultat med GENPLAT: (1) Skapande av optimerade blandningar av enskilda rena proteiner. Resultaten visar vilka enzymer är viktiga, och i vilka proportioner, samt vilka enzymer är inte viktigt. Vissa proteiner som finns rikligt i T. reesei secretome (Nagendran et al., 2009), som Cip1 och Cip2, verkar spela någon roll i Glc frigivning från majs Stover förbehandlade med ammoniak fiber expansion (AFEX) eller alkalisk hyd Rogen peroxid (AHP) (Banerjee et al. 2010b). Å andra sidan, vissa proteiner är oväntat viktig. Till exempel, endo-xylanases av glykosyl hydrolas familjer 10 och 11 är båda viktiga för Glc frigivning, en xylanas kan inte ersätta den andra (Banerjee et al, 2010b, c.). Cel61A, en mindre protein i T. reesei secretome, är mycket viktigt för Glc men inte XYL release. Vissa enzymer är viktiga för utsläpp av både Glc och XYL, medan andra är nödvändigt endast för det ena eller det andra (Banerjee et al. 2010c). En syntetisk blandning som innehåller 16 delar, vardera med en koncentration av 0,94 mg / ml (dvs. en icke-optimerad blandning), släppt 38% av de tillgängliga Glc från AFEX förbehandlat DDG. Under identiska hydrolys förhållanden, en optimerad blandning, där koncentrationerna av de 16 komponenterna varierade från 0% till 32%, släppt 52% av Glc (Fig. 2). Detta experiment illustrerar nyttan av att bygga definierade blandningar. _content "> (2) Skapande av optimerade cocktails för olika förbehandling / kombinationer substrat. Dagens kommersiella cellulas preparat är" one-size-fits-all ". I verkligheten beror det bästa cocktail på både substrat och förbehandling. En enda produkt såsom Accellerase 1000 ger olika avkastning från olika substrat förbehandlats på samma sätt, och från samma substrat utsätts för olika förbehandlingar (Fig. 1). Vi har använt GENPLAT att optimera blandningar av rena enzymer för flera förbehandlingar och mutiple råvaror (Banerjee et al. 2010c). Figur 2 visar hur den optimala enzym proportioner av 16 rena enzymer är olika för AFEX förbehandlat majs Stover, AHP förbehandlat majs Stover och AFEX förbehandlat DDG. Endast 11 enzymer visas i bild. 2 eftersom den optimala proportionerna av de övriga fem (Cel61B, AbfB, Cip1, Cip2 och Cel12A) befanns vara 0% (Banerjee et al. 2010c). (3) Nya enzym upptäckt </strOng>. Byggandet av optimerade blandningar av rena proteiner är en pågående process. När nya proteiner blir tillgängliga i ren form (från kommersiella källor, genom heterologa uttryck eller genom rening), kan de systematiskt testas genom att lägga till dem till den aktuella optimerad uppsättning. Nya proteiner som bidrar till Glc eller XYL släpp blir då en del av en ny, optimerad set. På detta sätt blir GENPLAT en plattform för identifiering av nya enzymer för biomassa dekonstruktion. Vi har gjort extrakt av svampar än T. reesei och A. niger odlas på olika substrat. En särskild extrakt ökat Glc avkastning när inkom i vårt kärna. De ansvariga protein renat och visat sig vara en roman glykosyl hydrolas inte finns i någon kommersiell enzympreparat (Banerjee och Walton, opublicerade resultat). (4) Upptäckt av bättre enzymer. Ha visat med GENPLAT vilka enzymer som är viktigast för nedbrytning av ettsärskilt biomassa, vi har en bättre förståelse för vilka enzymer bör stå i fokus för förbättringar. Bättre exempel på kritiska enzymer kan hittas genom att söka i naturen eller som görs av protein engineering. (Ett enzym som skulle kunna vara "bättre" än sin T. reesei homolog på flera olika sätt, beroende på önskad egendom, minskade exempelvis högre specifik aktivitet, bättre samverkan, proteolytiska känslighet eller ökad termisk stabilitet). GENPLAT ger en meningsfull plattform för testmetoder potentiellt bättre enzymer, eftersom den använder en realistisk komplex blandning (viktigt för att ingen biomassa enzym fungerar isolerat) och ett realistiskt substrat (viktigt eftersom resultat med ren cellulosa eller andra artificiella substrat kanske inte är relevanta för naturliga lignocellulosa material). (5) Kommersiell enzym optimering. Tillräckligt stora mängder ren enzymer ännu inte existerar i den verkliga världen. Tills de gör, etanol proproducenter måste förlita sig på kommersiella produkter som Accellerase 1000 och MultifectXylanase. Men blandningar av kommersiella enzymer är generellt bättre än någon individ ett, och GENPLAT kan användas för optimerad cocktails av flera kommersiella enzymer. Figur 3 visar användningen av GENPLAT för att optimera en blandning av fyra kommersiella enzympreparat. Den optimala proportionerna för frisläppande av GLC från AFEX förbehandlat DDG befanns vara 47% Accellerase1000, 27% Multifect Pectinase, 22% Novozyme 188, och 4% Multifect Xylanase (Banerjee et al. 2010c). Figur 3B visar skillnaderna i Glc avkastningen från AFEX-DDG med fyra enzympreparat, den optimerade kommersiella blandning ger högre Glc avkastning än Accellerase1000 ensam, SpezymeCP ensam, eller en 16-komponent syntetisk blandning. Detta experiment visar också att 16-komponenten syntetisk blandning saknas en eller flera enzymer som behövs för optimal Glc frigivning, som finns i en eller flera av de kommersiella enzymer. GENPLAT kan vara ossed för att identifiera sådana komponenter. Figur 1. Ingen enskild kommersiell enzympreparat är optimal för alla material och alla förbehandlingar. Fem substrat och tre förbehandlingar jämfördes på liknande villkor för slipning (0,5 mm partikelstorlek), enzym lastning (15 mg / g glukan) och villkor hydrolys (48 h, 50 ° C). A. Rötning av olika AFEX förbehandlat substrat med Accellerase 1000. B. Rötning av majs Stover förbehandlade av tre olika metoder med Accellerase 1000 (se Banerjee et al. 2010c). Figur 2. Optimal andel av 11 enzymer för utsläpp av Glc från AFEX förbehandlat majs Stover (AFEX-CS), alkaliska väteperoxid förbehandlat majs Stover (AHP-CS) eller AFEX förbehandlat torkat destillerakundernas korn (AFEX-DDG). Uppgifterna kommer från Banerjee et al. (2010c). Siffror längst upp i staplarna är Glc avkastningar som en procent av den totala Glc i biomassa provet. Figur 3. A. Användningen av GENPLAT för att producera en optimal blandning av fyra kommersiella enzympreparat för frisläppande av GLC från AFEX förbehandlat DDG. Multifect Xylanase gjorde minsta bidrag (4%) och var därför utelämnats från denna ternära diagram. B. Glc avkastningen från AFEX-DDG med olika enzym behandlingar under identiska hydrolys villkor (15 mg / g glukan enzym, 48 h, 50 ° C) . "Fyra-komponent kommersiella" har proportionerna bestäms från experimentet visas i bild. 3A.

Discussion

Det är allmänt erkänt att minska kostnaden för enzymer är viktigt för utvecklingen av en ekonomisk lignocellulosiska etanolindustrin. För närvarande finns kommersiella enzym cocktails är komplexa och dåligt definierade blandningar av många proteiner (Nagendran et al., 2009), och de är anpassade främst för användning på syra-förbehandlat majs Stover. För att påskynda utvecklingen av bättre enzym cocktails har flera laboratorier utvecklat hög genomströmning plattformar för enzym upptäckt och karakterisering. Insatserna på detta område har införlivat ett eller flera av följande egenskaper som också finns i GENPLAT: robotiserade dispensering av enzymer och slurry biomassa, statistisk uppläggning av experiment och / eller automatisk bestämning av Glc och XYL (Berlin et al, 2007; Decker et. al, 2009;. Kim et al, 1998;. King et al, 2009).. GENPLAT utvidgar dessa tidigare insatser, mest markant i komplexiteten av enzymet blandningar som kan analyseras från som mest 6 komponenter itidigare studier för att mer än 16 i vårt senaste arbete (Banerjee et al. 2010c). Ytterligare viktiga funktioner i GENPLAT är användning av en pärla blandningskammare (paddla reservoar) som kan hålla Stover slurry avbrytas under dispensering, varsam blandning under matsmältningen vid utgången av över-end-rotation, och automatiserad kolorimetrisk bestämning av Glu och XYL.

Materials

Equipments and software used:

1. Design–Expert software ,Version 8.0 (Stat-Ease, Inc., Minneapolis, MN) (http://www.statease.com)
2. Biomek FXP laboratory automation workstation (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
3. Biomek FXP software, Version 3.3 (Beckman-Coulter, Fullerton, CA)
4. Paddle reservoir (Model VP 756C-1P100, V & P Scientific Inc., San Diego)
5. Plates, 96-deep (1.5-ml) well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
6. Pierceable capmats (USA Scientific, Ocala, FL)
7. Rotating hybridization incubator (Model 5420,VWR)
8. Swinging-bucket centrifuge (Model 5810R, Eppendorf, Hamburg, Germany)
9. Plates, Costar 96-well (Abgene, Fisher Scientific, Epson, UK)
10. Plates, 384-well (BD Falcon, BD Biosciences, San Jose, CA)

Reagents used:

1. Pichia pastoris and vectors: strain X33, and pPICZ and pPICZ_α (Invitrogen, Carlsbad, CA)
2. T. reesei and vectors: strain QM9414 (US Department of Agriculture National Center for Agricultural Utilization Research, Peoria, IL), and pCB1004-EV (Banerjee et al., 2010b)
3. Accellerase 1000 (lot number 1600844643) (Genencor, Inc., Rochester, NY)
4. 50 mM sodium citrate buffer, pH 4.8
5. Tetracycline stock: 10 mg/ml
6. Cycloheximide stock: 10 mg/ml
7. GOPOD assay kit , catalog K-GLUC (Megazyme, Bray, Ireland)
8. Xylose assay kit, catalog K-XYLOSE (Megazyme, Bray, Ireland)