抗体マイクロアレイと蛍光多重を用いた大腸癌の細胞表面タンパク質のプロファイリング
Summary
我々は、その後、表面抗原（DotScan CRCマイクロアレイ）を認識するカスタマイズされた抗体のマイクロアレイ上に捕捉されている実行可能な単一の細胞を、生成するために大腸癌（CRC）の分解のために手順を説明した。マイクロアレイに結合した細胞のサブ集団は、蛍光色素でタグ付けされたモノクローナル抗体を用いた蛍光多重化によってプロファイル化することができます。
Abstract
CRCの現在の予後との分類は、病理組織学的および臨床所見を統合するシステムをステージングに依存しています。しかし、CRCのケースの大半で、細胞の機能不全は、蛋白質の発現と翻訳後修飾1を修正する多数の突然変異の結果である。
分化（CD）抗原のクラスターを含む細胞表面抗原、、の数は、CRCの潜在的な予後や転移性のバイオマーカーとして同定されている。これらの抗原は、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）および腫瘍関連マクロファージ（TAMS）のような他の細胞型で腫瘍の進行や相互作用とその発現しばしば変更、として理想的なバイオマーカーを作る。
癌のサブ分類と予後のための免疫組織化学（IHC）の使用はいくつかの腫瘍タイプ2,3のために確立されます。しかし、単一の"マーカーは、"臨床病理病期分類よりも大きな予後的意義を示していないか、すべてのCRCケースのルーチン病理報告で使用するために広く受け入れられています。
疾患の表現型の予後の層別化により最近のアプローチは、複数の"マーカー"を使用して表面のタンパク質プロファイルに依存しています。 such iTRAQとしてproteomic手法を用いて腫瘍の発現プロファイリングがbiomarkers4の発見のための強力なツールですが、それは検査室で日常的に使用するための最適ではありません及び混合集団で異なる種類の細胞を区別することはできません。さらに、腫瘍組織の大量のこれらの方法によって精製の細胞膜糖タンパク質のプロファイリングに必要とされています。
このビデオでは、DotScan CRCの抗体のマイクロアレイを用いた非集計CRCのサンプルから生細胞の表面にプロテオームのプロファイリングのためのシンプルな方法を説明した。 122 -抗体のマイクロアレイは、CRCのための40潜在的に予後マーカーの検出のための衛星地域と一緒に、系統特異的白血球マーカー、接着分子、受容体と炎症と免疫応答5のマーカーの範囲を認識し、標準の82 -抗体の地域で構成されています。細胞は、それらが対応する抗原を発現するための抗体に捕捉されています。光学走査によって決定されるドットあたりの細胞密度は、その抗原を発現する細胞の割合は、抗体6の抗原と親和性の発現のレベルを反映している。
CRCの組織または正常な腸の粘膜の場合は、光学スキャンは、細胞の混合集団の免疫表現型を反映している。蛍光多重化は、アレイ上に捕捉された目的の細胞の選択したサブ集団をプロファイルするために使用することができます。例えば、アレクサ647 -抗上皮細胞接着分子（EpCAM、CD326）は、フィコエリスリン、抗CD3、使用されている間、、CRC細胞とまた正常な腸粘膜の上皮細胞を検出するために使用されたパン上皮分化抗原であるT -細胞7浸潤を検出する。 DotScan CRCマイクロアレイは、解剖学的にベースのCRCのステージングシステムへの診断の代替のためのプロトタイプにする必要があります。
Protocol
Discussion
このビデオでは、我々はDotScan抗体のマイクロアレイは、CRCの組織からの細胞集団のために表面抗原のプロファイルを研究するために、単純な、半定量的な方法で使用することができる方法を示します。
エネルギー依存性のプロセス（例えば、キャッピング抗原および/または偽足形成が）、インキュベーション中の抗体のドットの全細胞の強固な結合に必要であるように…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、CRCと正常な腸粘膜の新鮮なサンプルを収集するためのロイヤルプリンスアルフレッドとコンコードの送還病院の解剖学的病理学研究所のスタッフに感謝。仕事は癌研究所ニューサウスウェールズ州トランスレーショナルプログラムの助成金によって賄われていた。
Materials
| Name of reagent or equipment | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Hanks’ balanced salt solution | Sigma-Aldrich | H6136-10X1L | Buffered with 25 mM Hepes (Sigma #H3375) |
| Airpure biological safety cabinet class II | Westinghouse | 1687-2340/612 | |
| Surgical blades | Livingstone | 090609 | Pack of 100 |
| RPMI 1640 with 2 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R4130-10X1L | |
| Collagenase type 4 | Worthington | 4188 | |
| Deoxyribonuclease 1 | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Terumo Syringe (10 mL) | Terumo | SS+10L | Box of 100 |
| Filcon filter (200 μm) | BD Biosciences | 340615 | |
| Filcon filter (50 μm) | Filcon filter (50 μm) | Filcon filter (50 μm) Filcon filter (50 μm) 340603 | |
| Fetal calf serum | Gibco/Invitrogen | 10099-141 | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 7017 | |
| Dimethyl sulphoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Hemocymeter Technocolor Neubar | Hirschmann | not available | |
| Light microscope | Nikon | Nikon TMS | |
| Cyrovial tubes | Greiner bio-one | 121278 | |
| Cryo freezing contrainer | Nalgene | 5100-0001 | |
| DotScan antibody microarray kit | Medsaic | not available | |
| DotScan microarray wash tray | Medsaic | not available | |
| KimWipes | Kimberly-Clark | 4103 | |
| Formaldehyde 37% | Sigma-Aldrich | F1635-500ML | |
| DotReaderTM | Medsaic | not available | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A9418-10G | |
| Heat-inactivated AB serum 2% | Invitrogen | 34005100 | |
| Phycoerythrin-conjugated CD3 | Beckman Coulter | ET386 | |
| AlexaFluor647-conjugated EpCAM | BioLegend | 324212 | |
| Typhoon FLA 9000 | GE Healthcare | 28-9558-08 | 532 nm laser, 580 BP30 emission filter for PE. 633 nm laser and 670 BP30 emission filter for Alexa647 |
| MultiExperiment Viewer v4.4 | TM4 Microarray Software Suite | Open – source software (Ref 11) |
References
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