Un metodo per monitorare l'attività ubiquitina-proteasoma in cellule viventi è descritto. Un degron-destabilizzato GFP-(GFP-dgn) e di una stalla GFP-dgnFS proteina di fusione vengono generati e trasdotto nella cella utilizzando un vettore lentivirale espressione. Questa tecnica permette di generare una linea cellulare stabile GFP-dgn/GFP-dgnFS esprimendo in cui ubiquitina-proteasoma attività può essere facilmente valutata usando epifluorescenza o citometria a flusso.
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Articolo metodologico
Monitoraggio del sistema ubiquitina-proteasoma attività nelle cellule viventi Utilizzando una degron (dgn)-destabilizzato proteina verde fluorescente (GFP) a base di proteine Reporter
In questo articolo
Sommario
Abstract
Proteasoma è l'organello intracellulare principale coinvolto nella degradazione proteolitica della anormali, proteine misfolded, danneggiati o ossidati 1, 2. Manutenzione delle attività del proteasoma è stato coinvolto in molti processi cellulari chiave, come risposta allo stress cellulare 3, regolazione del ciclo cellulare e la differenziazione cellulare 4 o nella risposta del sistema immunitario 5. La disfunzione del sistema ubiquitina-proteasoma è stata correlata allo sviluppo di tumori e malattie neurodegenerative 4, 6. Inoltre, una diminuzione dell'attività del proteasoma trovato è una caratteristica della senescenza cellulare e organismal invecchiamento 7, 8, 9, 10. Qui, vi presentiamo un metodo per misurare ubiquitina-proteasoma attività in cellule viventi usando un GFP-DGN proteina di fusione. Per poter controllare ubiquitina-proteasoma attività nelle cellule viventi primarie, DNA complementare costruisce codificante per una proteina fluorescente verde (GFP)-DGN proteina di fusione (GFP-DGN, instabile) e una variante portando una mutazione frameshift (GFP-dgnFS, stabile 11) sono inseriti in vettori di espressione lentivirali. Preferiamo questa tecnica rispetto alle tecniche tradizionali di transfezione in quanto garantisce una elevata efficienza di trasfezione molto indipendente dal tipo di cellula o l'età del donatore. La differenza tra fluorescenza visualizzata dal GFP-dgnFS (stabile) proteine e la proteina destabilizzato (GFP-dgn) in assenza o presenza di inibitori del proteasoma può essere usato per stimare ubiquitina-proteasoma attività in ciascun ceppo cella particolare. Queste differenze possono essere monitorati mediante microscopia in epifluorescenza o può essere misurata mediante citometria a flusso.
Protocollo
1. Costruzione plasmide
- Ordine personalizzato oligo-nucleotidi codifica per DGN (ACKNWFSSLSHFVIHL 11) e per dgnFS (HARTGSLACPTSSSICE) e legare esso nel pEGFP-C1 vettore per ottenere la fusione della GFP con DGN / dgnFS (Figura 1).
- Amplifica la sequenza codificante per GFP-DGN e GFP-dgnFS mediante PCR secondo il protocollo della clonazione pENTR direzionale Kit TOPO e continuare con il pLenti6/V5 direzionale TOPO Cloning Kit (Figura 6).
2. Virus di produzione
- Il giorno prima della transfezione (giorno 1) sementi su cellule HEK 293FT in fiasche T75 un modo ch....
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Discussione
La prima pubblicazione con la proteina fluorescente verde (GFP) come substrato reporter per ubiquitina-proteasoma attività è stata pubblicata nel 2000 12. Da allora, la GFP è diventata uno strumento comune per visualizzare le attività cellulari, in particolare il sistema ubiquitina-proteasoma processo. Per monitorare ubiquitina-proteasoma attività in vivo un modello di topo transgenico con GFP-reporter è stato introdotto 13. Ulteriori ricerca in vivo stabilito un altro modello di .......
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Dichiarazioni
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Ringraziamenti
Questo studio è stato finanziato da: National Research Network on Aging (NFN S93) dalla Science Foundation austriaco (FWF), Commissione europea integrata Progetti MIMAGE e PROTEOMAGE, Netherlands Genomics Initiative / Organizzazione olandese per la ricerca scientifica (NGI / NWO, 05040202 e 050 - 060-810 LPN), finanziato dall'UE, Rete di eccellenza Durata (6 ° PQ 036894), e il Programma Innovation Research Oriented sulla genomica (SenterNovem, IGE01014 e IGE5007).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Nome del reagente | Azienda | Numero di catalogo | |
| pEGFP-C1 Vector | BD Bioscience Clontech | 6084-1 | |
| pENTR direzionale TOPO Cloning Kit | Invitrogen | K2400-20 | |
| pLenti6/V5 direzionale TOPO Cloning Kit | Invitrogen | V496-10 | |
| Lipofectamine 2000 Reagente | Invitrogen | 11668019 | |
| DMEM | Sigma | D5546 | |
| PVDF filtro (Rotilabo-Spritzenfilter) | Roth | P667.1 | |
| Polietilene glicole | Sigma | P2139 | |
| NaCl | Merck | 1.06404.1000 | |
| Fosfato Dulbecco Buffered Saline 1x (PBS) | Invitrogen | 14190 | |
| hexadimethrine bromuro | Sigma | 10,768-9 | |
| Blasticidina | Invitrogen | R21001 | |
| Cristallo viola | Sigma | C3886 | |
| FACS tubi | BD Biosciences | ||
| Penicillina Streptomicina (Pen-Strep) | Invitrogen | 15140130 | |
| L-glutammina 200 mM | Invitrogen | 25030024 | |
| Siero bovino fetale (FBS) | Biochrom AG | S0115 | |
| MEM Aminoacidi non essenziali (NEAA) 100x | Invitrogen | 11140035 | |
| MEM Piruvato di sodio 100 mM | Invitrogen | 11360039 | |
| D-(+)-glucosio (45%) | Sigma | G8769 | |
| Geneticin | Invitrogen | 11811023 | |
| CaCl2 | Merck | C5080 | |
| Hepes | Sigma | H3375 | |
| Tripsina-EDTA (0,05%) | Invitrogen | 25300054 |
Riferimenti
- Coux, O., Tanaka, K., Goldberg, A. L. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes. Annu. Rev. Biochem. 65, 801-847 (1996).
- Davies, K. J. Degradation of oxidized proteins by the 20S proteasome. Biochimi. 83, 301-310 (2001).
- Stangl, K., Stangl, V.
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Ristampe e permessi
