ניתוח של נדידת תאים עצביות קרסט טרונק באמצעות Assay השתנה Zigmond הקאמרי

Summary

גישה לנתח את ההגירה של תאים (תאי explanted רכס עצביים גזע) הוא תאר. שיטה זו היא זולה, עדינה, ומסוגלת להבחין chemotaxis משני chemokinesis והשפעות אחרות על קוטביות נדידה כגון אלה נגזרים מאינטראקציות תא תא בתוך התרבות העיקרית הגזע עצבי פסגת התא.

Abstract

תאי רכס עצביים (NCCs) הם אוכלוסייה זמנית של תאים הנמצאים בפיתוח חוליות שלהגר מצינור העצבי הגבה (NT) לאחר שעבר ^1,2 מעבר אפיתל-mesenchymal. בעקבות EMT, NCCs לנדוד מרחקים גדולים לאורך מסלולים סטריאוטיפיים עד שהם מגיעים ליעדיהם. NCCs להתמיין למגוון רחב של סוגי תאים, כוללים תאי עצב, גליה המלנוציטים, תאי ^1-3 chromaffin. היכולת של NCCs להגיע ולהכיר מקומות היעד הנכונים שלהם היא יסוד להיווצרות המתאימה של כל המבנים המכילים תא מטען נגזר ^NCC-3 מרכיבים. הבהרת מנגנוני ההדרכה לגזע NCC הגירה הייתה אפוא עניין בעל חשיבות רבה. מולקולות רבות שהפגינו להדריך NCC הגירת ^4. לדוגמה, NCCs גזע ידוע להיות דחוי על ידי רמזי הדרכה שליליים כגון Semaphorin, Ephrin, וligands חריץ ^5-8. עם זאת, לאעד לאחרונה היה לי chemoattractants של NCCs מטען זוהה ^9.

גישות קונבנציונליות במבחנה ללימוד התנהגות chemotactic של תאי חסיד עבודה הטובה ביותר עם ​​תאים הנציחו, homogenously מופץ, אך מאתגרים יותר לפנות לתרבויות מסוימות העיקריות בתאי גזע שתחילה חסרות הפצה הומוגני ומהירות להבדיל (כגון NCCs). גישה אחת לומוגני חלוקת NCCs מטען ללימודי chemotaxis היא לבודד NCCs גזע מתרבויות explant NT העיקריות, ואז להרים וreplate להיות כמעט 100% confluent. עם זאת, גישה זו דורשת ציפוי כמויות ניכרות של זמן ומאמץ כדי explant מספיק תאים, היא קשה, ומפיצת NCCs מטען באופן שונה מזו שנמצא בתנאי vivo.

כאן, אנו מדווחים גישה במבחנה כי הוא מסוגל להעריך את התגובות נודדות Chemotaxis ואחרות של NCCs מטען ללא requirinGA חלוקת תא הומוגנית. טכניקה זו מנצלת הדמיה זמן לשגות של ראשוני, ואינה נרתעת NCCs מטען בתוך modified Zigmond קאמרי (קאמרי Zigmond סטנדרטי מתואר במקום אחר ^10). על ידי חשיפת NCCs מטען בפריפריה של התרבות לשיפוע chemotactant שניצבת ליווניות הטבעיות חזו, שינויים בקוטביות נודדת הנגרמים על ידי שיפוע chemotactant מיושם ניתן לאתר. טכניקה זו היא זולה, דורשת culturing של רק שני explants NT לטיפול לשכפל, נמנע מהרמת תא קשה (כגון trypsinization), משאיר NCCs מטען בהפצה דומה יותר לתנאי vivo, חותך את כמות הזמן בין explantation וניסויים (שסביר להניח מפחית את הסיכון לבידול), ומאפשר הערכת זמן לשגות של מאפיינים נודדים רבים.

Protocol

1. יום 1: בידוד של צינורות גזע עצביים לתרבות לילה על coverslips דגירת ביצי חומוס ל56 שעות ב 38 ° C. הסר את הביצים מדגירה, מרסס אותם במתינות עם אתנול 70%, ולאחר מכן לאפשר להם לייבוש. שובר את הביצים לרווחה אל תוך מגש זכוכית UV-מעוקר. …

Discussion

מחקר chemotaxis על NCCs הגזע הוכיח מאתגר עבור סדרה של סיבות. NCCs Trunk מהווה אוכלוסייה הטרוגנית של תאי גזע שתתמיין ואם תרבותי לטווח ארוך, ולכן יש לקבל NCCs הגזע מexplantation העיקרי של NT תא מטען ברמה. שיטות מקובלות ללימוד תגובת chemotactic של אוכלוסיות תאים חולקו homogenously במבחנה קשות לבדו?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
DMEM	Omega Scientific	DM-22
Penicillin Streptomycin Solution	Omega Scientific	PS-20	100X Stock Concentration
L-Glutamine	Omega Scientific	GS-60	100X Stock Concentration
Fetal Bovine Serum	Omega Scientific	FB-11	Lot# 105247 (or another that is comparable)
Modified Zigmond chamber	Home made	N/A	Reservoir volume: ~ 160 μl ea; for additional specifications, see Fig. 4 and the supplemental fabrication protocol
Cell culture dish	Denville	T6040	40 x 10 mm
Fibronectin	BD	354008	10X Stock prepped by diluting 1 mg FN in 1 ml H2O and 9 ml DMEM
Coverslips	Fisher	12-548-B	Precleaned; 22 x 22 mm
L15 medium	Thermo Scientific	SH30525.02
Petroleum Jelly	Comforts	011110794642	100%
Centrifuge tube	Biologix	10-9152	15 ml
Dispase	Cell Systems	4Z0-850	10X Stock Concentration
Syringe	BD	309602	1 ml
Needle	BD	305127	25 G x 1.5 in.
Alexa Fluor 488-IgM	Invitrogen	A21042	Stock is 2 mg/ml; 7 moles dye/mole IgM
Dissecting Forceps	FST	Misc.	Dumont #5 or 55; straight tipped; stainless steel or titanium
Tungsten Needle	N/A	N/A	Home made; placed in a pin holder
Blunt Forceps	Tiemann	160-18	Used for transferring embryos to Ringer’s from egg yolk

Supplemental Protocol: Fabrication of a Modified Zigmond Chamber

Please refer to Figure 4 as a reference for the protocol below:

1. Purchase a sheet of 3/16″ thick polished acrylic (4.45 mm actual thickness).
2. Using a table saw, cut chamber blanks oversized to the rough dimensions of 33.25 mm x 64.57 mm. This allows 3.175 mm extra material for machining.
3. Set the chamber blank on a vise. With a milling machine and a 6.35 mm (1/4″) end mill bit, finish machining the sides of the chamber to their exact dimensions: 30.07 mm x 61.39 mm.
4. Position the chamber blank on the milling machine and locate the center of the blank along both the x and y axes with an edge finder; then zero the center location.
5. Acquire the chamber height (z-axis) by touching the end mill bit to the top surface and zero the height.
6. Using a 3.91 mm (0.154″) end mill bit, offset the bit 3.03 mm along the x-axis (positive direction) for the first reservoir. Begin machining into the chamber to a depth of 2.84 mm while moving along the y-axis (positive direction) to 7.62 mm (0.300″) and then traverse to 7.62 mm (0.300″) in the opposite (negative) direction to a complete reservoir length of 15.24 mm (0.600″). Offset the bit to 3.03 mm (0.119″) along the x-axis (negative direction) and repeat the same process for the second reservoir.
7. Position the chamber on its edge and drill a hole using a 1.09 mm (0.043 in.) drill bit on the end of each reservoir (4 total) that connects the end of the reservoir to the side of the chamber for loading medium during experimentation.
8. Soak the chamber well in warm soapy water to help remove any chemical contaminants.
9. Soak and rinse the chamber well in double-distilled water to remove any soap. The chambers are now ready to use as described above.