Analys av Trunk neurallist cellmigration med en modifierad Zigmond Chamber analys

Summary

Ett tillvägagångssätt att analysera migration av explanterade celler (stam neurallisten celler) beskrivs. Denna metod är billig, mild och kan särskilja kemotaxi från både kemokines och andra influenser av flyttande polaritet såsom de härledda från cell-cell-interaktioner inom den primära stammen neurallisten cellodling.

Abstract

Neurala crest celler (NCC) är en övergående population av celler närvarande i vertebrat utveckling som emigrera från den dorsala neuralröret (NT) efter att ha genomgått en epitelial-mesenkymala övergång ^1,2. Efter EMT, NCC migrera stora avstånd längs stereotypa vägar tills de når sina mål. NCC differentierar till ett brett spektrum av celltyper inklusive nervceller, glia, melanocyter och kromaffinceller ^1-3. Förmåga NCC att nå och erkänna deras rätt målplatser är grundläggande för lämplig bildning av alla strukturer som innehåller stammen NCC-härledda komponenter ^3. Belysa mekanismerna för vägledning för bål NCC migrationen har därför varit en fråga av stor betydelse. Talrika molekyler har visats styra NCC migrering ^4. Till exempel, är trunk NCC känt att repelleras av negativa vägledning ledtrådar såsom semaforin, ephrin, och ligander Slit ^5-8. Men intetills nyligen har kemoattrahenter av bålen NCC identifierats ^9.

Konventionell in vitro metoder för att studera kemotaktiska beteende vidhäftande celler fungerar bäst med odödliggjorda fördelade likartad celler, men är mer utmanande att på vissa primära stamcellskulturer som initialt saknar en homogen fördelning och snabbt skilja (såsom NCC). Ett sätt att homogenisera fördelningen av bålen NCC för kemotaxi studier är att isolera trunk NCC från primära NT explantation kulturer lyft och förnyad utbredning dem att vara nästan 100% sammanflytande. Detta kräver dock plätering metod stora mängder tid och ansträngning att explantera tillräckligt många celler, är hård, och distribuerar trunk NCC på ett olik sätt som finns i di vivo förhållanden.

Här rapporterar vi en in vitro metod som kan utvärdera kemotaxi och andra flyttande svar bålen NCC utan requiringa homogen cellfördelning. Denna teknik utnyttjar time-lapse avbildning av primära, ostörda trunk NCC i en modifierad Zigmond kammare (en vanlig Zigmond kammare beskrivs på annat håll ^10). Genom att exponera trunk NCC vid periferin av kulturen till en chemotactant lutning som är vinkelrät mot deras förutsagda naturligt riktverkan, kan förändringar i flyttande polaritet inducerade av den pålagda chemotactant gradienten detekteras. Denna teknik är billig, kräver odling av endast två NT explantat per replikat behandling, undviker hårda celler lyft (såsom trypsinering), lämnar trunk NCC i en mer likartad distribution till in vivo förhållanden, skär ner den tid mellan explantation och experiment (vilket minskar troligen risken för differentiering), och tillåter tidsförlopp utvärdering av ett stort antal vandrande egenskaper.

Protocol

1. Dag 1: Isolering av bålen neurala rör för övernattning kultur på täckglas Inkubera chick ägg för 56 timmar vid 38 ° C. Ta bort ägg från inkubation milt spraya dem med 70% etanol, och låt dem torka. Bryt äggen öppna i en UV-steriliserad glastallriken. Utdrag varje embryo från sin äggula och placera den i chick Ringers. Gör detta genom att först skära runt dess blod öar med böjda sax, sedan med trubbiga pincett, plocka embryot upp av dess extraembryonic membran och placera den …

Discussion

Genomföra kemotaxi forskning på bål NCC har visat utmanande för en rad skäl. Trunk NCC utgör en heterogen befolkning stamceller som kommer att skilja om odlade lång sikt, därför måste trunk NCC erhållas från primär explantation av stammen nivå NT. Konventionella metoder för att studera den kemotaktiska responsen av homogent fördelade cellpopulationer in vitro är svåra att testa på bålen NCC sedan de först kräver att cellerna är isolerade och homogent återpläterade i kemotaxi kammare (t….

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
DMEM	Omega Scientific	DM-22
Penicillin Streptomycin Solution	Omega Scientific	PS-20	100X Stock Concentration
L-Glutamine	Omega Scientific	GS-60	100X Stock Concentration
Fetal Bovine Serum	Omega Scientific	FB-11	Lot# 105247 (or another that is comparable)
Modified Zigmond chamber	Home made	N/A	Reservoir volume: ~ 160 μl ea; for additional specifications, see Fig. 4 and the supplemental fabrication protocol
Cell culture dish	Denville	T6040	40 x 10 mm
Fibronectin	BD	354008	10X Stock prepped by diluting 1 mg FN in 1 ml H2O and 9 ml DMEM
Coverslips	Fisher	12-548-B	Precleaned; 22 x 22 mm
L15 medium	Thermo Scientific	SH30525.02
Petroleum Jelly	Comforts	011110794642	100%
Centrifuge tube	Biologix	10-9152	15 ml
Dispase	Cell Systems	4Z0-850	10X Stock Concentration
Syringe	BD	309602	1 ml
Needle	BD	305127	25 G x 1.5 in.
Alexa Fluor 488-IgM	Invitrogen	A21042	Stock is 2 mg/ml; 7 moles dye/mole IgM
Dissecting Forceps	FST	Misc.	Dumont #5 or 55; straight tipped; stainless steel or titanium
Tungsten Needle	N/A	N/A	Home made; placed in a pin holder
Blunt Forceps	Tiemann	160-18	Used for transferring embryos to Ringer’s from egg yolk

Supplemental Protocol: Fabrication of a Modified Zigmond Chamber

Please refer to Figure 4 as a reference for the protocol below:

1. Purchase a sheet of 3/16″ thick polished acrylic (4.45 mm actual thickness).
2. Using a table saw, cut chamber blanks oversized to the rough dimensions of 33.25 mm x 64.57 mm. This allows 3.175 mm extra material for machining.
3. Set the chamber blank on a vise. With a milling machine and a 6.35 mm (1/4″) end mill bit, finish machining the sides of the chamber to their exact dimensions: 30.07 mm x 61.39 mm.
4. Position the chamber blank on the milling machine and locate the center of the blank along both the x and y axes with an edge finder; then zero the center location.
5. Acquire the chamber height (z-axis) by touching the end mill bit to the top surface and zero the height.
6. Using a 3.91 mm (0.154″) end mill bit, offset the bit 3.03 mm along the x-axis (positive direction) for the first reservoir. Begin machining into the chamber to a depth of 2.84 mm while moving along the y-axis (positive direction) to 7.62 mm (0.300″) and then traverse to 7.62 mm (0.300″) in the opposite (negative) direction to a complete reservoir length of 15.24 mm (0.600″). Offset the bit to 3.03 mm (0.119″) along the x-axis (negative direction) and repeat the same process for the second reservoir.
7. Position the chamber on its edge and drill a hole using a 1.09 mm (0.043 in.) drill bit on the end of each reservoir (4 total) that connects the end of the reservoir to the side of the chamber for loading medium during experimentation.
8. Soak the chamber well in warm soapy water to help remove any chemical contaminants.
9. Soak and rinse the chamber well in double-distilled water to remove any soap. The chambers are now ready to use as described above.