एक कम बजट लेजर Axotomy प्रणाली के निर्माण में अध्ययन Axon पुनर्जनन सी. एलिगेंस</em
Summary
लेजर axotomy समय चूक इमेजिंग के द्वारा पीछा में परिवर्तन के प्रभाव परख के लिए एक संवेदनशील तरीका है<em> सी. एलिगेंस</em> अक्षतंतु उत्थान पर. एक उच्च गुणवत्ता, लेकिन सस्ती, लेजर पृथक प्रणाली को आसानी से ज्यादातर सूक्ष्मदर्शी जोड़ा जा सकता है. 15 घंटे से अधिक समय व्यतीत हो इमेजिंग कीड़ा के सावधान स्थिरीकरण की आवश्यकता है.
Abstract
Laser axotomy followed by time-lapse microscopy is a sensitive assay for axon regeneration phenotypes in C. elegans1. The main difficulty of this assay is the perceived cost ($25-100K) and technical expertise required for implementing a laser ablation system2,3. However, solid-state pulse lasers of modest costs (<$10K) can provide robust performance for laser ablation in transparent preparations where target axons are “close” to the tissue surface. Construction and alignment of a system can be accomplished in a day. The optical path provided by light from the focused condenser to the ablation laser provides a convenient alignment guide. An intermediate module with all optics removed can be dedicated to the ablation laser and assures that no optical elements need be moved during a laser ablation session. A dichroic in the intermediate module allows simultaneous imaging and laser ablation. Centering the laser beam to the outgoing beam from the focused microscope condenser lens guides the initial alignment of the system. A variety of lenses are used to condition and expand the laser beam to fill the back aperture of the chosen objective lens. Final alignment and testing is performed with a front surface mirrored glass slide target. Laser power is adjusted to give a minimum size ablation spot (<1um). The ablation spot is centered with fine adjustments of the last kinematically mounted mirror to cross hairs fixed in the imaging window. Laser power for axotomy will be approximately 10X higher than needed for the minimum ablation spot on the target slide (this may vary with the target you use). Worms can be immobilized for laser axotomy and time-lapse imaging by mounting on agarose pads (or in microfluidic chambers4). Agarose pads are easily made with 10% agarose in balanced saline melted in a microwave. A drop of molten agarose is placed on a glass slide and flattened with another glass slide into a pad approximately 200 um thick (a single layer of time tape on adjacent slides is used as a spacer). A “Sharpie” cap is used to cut out a uniformed diameter circular pad of 13mm. Anesthetic (1ul Muscimol 20mM) and Microspheres (Chris Fang-Yen personal communication) (1ul 2.65% Polystyrene 0.1 um in water) are added to the center of the pad followed by 3-5 worms oriented so they are lying on their left sides. A glass coverslip is applied and then Vaseline is used to seal the coverslip and prevent evaporation of the sample.
Protocol
Discussion
वहाँ अलग अलग लेजर प्रणाली 3,5-11 के साथ कई अच्छे लेजर microsurgery की चर्चा कर रहे हैं. Femtosecond आईआर लेज़रों subcellular 12 और सुविधाजनक अगर एक इमेजिंग सुविधा के साथ जुड़े लेजर पृथक के लिए "सोने के मानक 'कर रहे हैं, लेकिन वे अक्सर व्यक्तिगत उपयोगकर्ताओं के लिए बहुत महंगा है. यदि आप इमेजिंग की गहराई की वजह से एक femtosecond IR लेजर इमेजिंग के लिए अपने नमूना की आवश्यकता है तो आप शायद एक लेजर axotomy के लिए की आवश्यकता होगी. सतह के 30-50 उम के भीतर लक्ष्य axons के साथ पारदर्शी ऊतकों शायद 20 / UJ नाड़ी एक उच्च ना विसर्जन लेंस के माध्यम से लक्षित रेंज में नीले और हरे रंग पल्स लेज़रों के साथ संभव है. नैनो और femtosecond लेजर के साथ तुलना पिको दूसरा लेज़रों के साथ संपार्श्विक क्षति, लक्ष्य अक्षतंतु बढ़ की गहराई के रूप में विशेष रूप से सी.. एलिगेंस पारदर्शी है और सभी axons सतह के 20-30 उम के भीतर हैं . हम नियमित रूप से मोटर axons कि सतह के 5 उम के भीतर हैं काटा. हम भी आसानी से कुल्हाड़ी कटौतीतंत्रिका अंगूठी के भीतर ons है कि छल्ली सतह से लगभग 20 उम हैं. हम axons को काटने के लिए एक वयस्क कृमि के व्यास के माध्यम से के बारे में 30-50 उम के लिए सीमा मिला. यह संभावना है कि लेजर पृथक यहाँ वर्णित व्यवस्था अच्छी तरह से कई अलग अलग तैयारी है कि लक्ष्य axons की पारदर्शिता और गहराई के मापदंड फिट के साथ काम करेगा. फिर भी, यह थोड़ा आश्चर्य की बात है femtosecond पराबैंगनीकिरण आईआर कि नैनो और picosecond 355 एनएम और 532 एनएम लेज़रों के सैद्धांतिक लाभ दिया, सी. में लेजर axotomy के लिए इतनी अच्छी तरह से प्रदर्शन 6,13 एलिगेंस. हम साथ 440 एनएम nanosecond nanosecond 532 एनएम, और आईआर femtosecond पराबैंगनीकिरण लेजर axotomy के जवाब में अक्षतंतु पुनर्जनन में कोई मतभेद देखते हैं.
ठोस राज्य के 355 एनएम यूवी लेज़रों के रूप में एक ही लागत के बारे में हैं 532 एनएम क्यू स्विचड ठोस राज्य लेजर डायोड निष्क्रिय पंप, लेकिन या तो उच्च शक्तियों या प्रकाशिकी कि कुशलतापूर्वक इन छोटे तरंगदैर्य से गुजारें की आवश्यकता है. अधिकांश प्रकाशिकी के लिए 400 दिखाई के साथ अच्छा प्रदर्शन करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं -700 एनएम प्रकाश. कम प्लाज्मा दहलीज, छोटे स्थान आकार, और एक लंबे पास dichroic कुशलता से लक्षित करने के लिए पृथक लेजर के 100% प्रत्यक्ष और नमूना संकेत की हानि के बिना GFP के युगपत इमेजिंग की अनुमति के रूप में जैसे 6 355 एनएम लेज़रों कुछ लाभ की पेशकश करेगा. ब्लू 440 एनएम लेज़रों एक दृश्य प्रकाश लेजर (मानक प्रकाशिकी और सुरक्षा के साथ अच्छा प्रदर्शन) के साथ काम करने के फायदे बनाए रखने होगा. दुर्भाग्य से, एक DPP Q बंद ठोस राज्य के 440 एनएम लेजर की लागत 3 बार एक 355nm या इसी तरह की सत्ता के इस समय में 532 एनएम लेजर की लागत है. यदि हम सी. के लिए एक नई प्रणाली डिजाइन कर रहे थे एलिगेंस, जहां लक्ष्य गहराई कम है, हम 1 पर एक यूवी पारदर्शी (355nm पर 50-70% के संप्रेषण के साथ लागत के बारे में एक 40x 1.3na तेल लेंस के लिए 3,000 डॉलर) लेंस और एक 355 एनएम 5-10 UJ / नाड़ी उत्पादन लेजर के लिए चुनते हैं -20 kHz.
Axon पृथक प्लाज्मा गठन के लिए कारण माना जाता है. छोटा दालों कम बिजली और प्लाज्मा मात्रा w प्लाज्मा थ्रेसहोल्ड उत्पादन होगा बीमार 6 छोटे हो. लक्ष्य के लिए सबसे कम बिजली पल्स ऊर्जा समायोजन करके छोटी और कम से कम रहते प्लाज्मा का उत्पादन होता है. बड़े लंबे समय रहते plasmas cavitation बुलबुले उत्पन्न होगा कि क्षति कोशिकाओं के आसपास. हम आम तौर पर पाया है कि सर्वोच्च आवृत्ति (यानी 2.5kHz) में 5-10 के बारे में दालों का उपयोग पृथक सबसे अच्छा परिणाम देता है. यह पता चलता है कि नुकसान धीरे – धीरे बेहतर क्षति की सीमा पर नियंत्रण के लिए दालों की एक श्रृंखला पर एकीकृत किया जा सकता है कि. लेजर पृथक यहाँ वर्णित प्रणाली बहुत क्षमा है अगर बीम और गठबंधन का विस्तार सही. हम 10% लेसर शक्ति (0.3 मेगावाट की औसत 2500 हर्ट्ज में मापा और अनुमान 1 UJ / नाड़ी) में वयस्क कीड़े में axons काटने शुरू है और 14% बिजली के माध्यम से सीमित स्थानीयकृत क्षति के साथ में कटौती कर सकते हैं. आप 15-39% लेसर शक्ति से क्षति के बड़े क्षेत्रों का निरीक्षण कर सकते हैं, लेकिन केवल 40% बिजली (के बारे में 1 मेगावाट औसत 2500 हर्ट्ज में मापा) के ऊपर कीड़े बड़े cavitation बुलबुले और कीड़ा छल्ली को नुकसान की वजह से विस्फोट.
e_content "> Steinmeyer एट अल 2010 2 कागज एक लेजर पृथक प्रणाली के निर्माण के लिए एक उत्कृष्ट संसाधन है. लियोन एवरी भी एक लेजर पृथक एक सस्ती N2 गैस 337 एनएम लेजर पर आधारित प्रणाली का एक अच्छा वर्णन व्यावहारिक है और वह कुछ महान व्यावहारिक प्रदान करता है (elegans.swmed.edu / / Worm_labs एवरी /) सलाह. जब अपनी खुद की प्रणाली डिजाइन आप पहली बार अपने खुर्दबीन के प्रतिनिधि के साथ बात करने के लिए निर्धारित कैसे खुर्दबीन उद्देश्य के लिए पृथक लेजर लक्षित करने के लिए चाहिए आपका माइक्रोस्कोप एक कंपन अलगाव की मेज पर रखा होना चाहिए. (न्यूपोर्ट, TMI, थोर) एक breadboard शीर्ष इष्टतम है, लेकिन अभी भी एक ठोस इस्पात शीर्ष चुंबकीय positioners के साथ प्रयोग किया जा सकता है एक ईमानदार गुंजाइश पर एक समर्पित मध्यवर्ती मॉड्यूल अच्छा है क्योंकि सभी ऑप्टिकल तत्वों जगह में छोड़ा जा सकता है है. लेकिन यह, कम खर्चीला और अधिक करने के लिए एक कैमरा (उल्टे) बंदरगाह या एक "combiner" एक महामारी फ्लोरोसेंट बंदरगाह से जुड़ी का उपयोग करने के लिए सुविधाजनक हो सकता है. तुम वापस एपर्चर और संप्रेषण के आकार पता है की जरूरत है (एक में उद्देश्य लेंस के blation लेजर) तरंगदैर्ध्य आप उपयोग करना चाहते हैं. एक बार जब आप (जैसे, Crylas, कुलबुलाना, क्रिस्टल, या सीआरसी) लेजर आप सही ऑप्टिकल तत्वों, हार्डवेयर और सुरक्षा उपकरणों का चयन के साथ मदद के लिए थोर या न्यूपोर्ट से संपर्क करना चाहिए पर फैसला. हम एक दोहरी गलीली बीम अंतरिक्ष को बचाने के विस्तारक पर फैसला किया है, लेकिन एक सरल Keplerian विस्तारक (f2/f1 = विस्तार कारक) एक विकल्प है. एक कस्टम बीम विस्तारक कम से कम महंगी हो जाएगा, लेकिन न्यूपोर्ट, थोर, और लेजर निर्माताओं में से कई उत्कृष्ट गुणवत्ता वाणिज्यिक बीम विस्तारक प्रदान करते हैं. कुछ लेजर निर्माताओं भी है कि लागत प्रभावी और अंतरिक्ष की बचत हो सकता है मैनुअल और इलेक्ट्रॉनिक नियंत्रित attenuators का प्रस्ताव है, लेकिन polarizer Glan थॉम्पसन और आधे लहर थाली के रूप में के रूप में बहुमुखी नहीं है. आप यह भी तय कैसे लेजर को नियंत्रित करने के लिए की आवश्यकता होगी. आप एक LabVIEW आधारित नियंत्रक डिजाइन, एक वाणिज्यिक टीटीएल जनरेटर, या सॉफ्टवेयर लेजर कंपनी द्वारा प्रदान का उपयोग कर सकते हैं. विशिष्ट निर्माता के साथ लेजर विकल्पों पर चर्चा करें. "तम्बू> हम प्रणाली यहाँ वर्णित है के बारे में 15,000 डॉलर की लागत जब हमारे मौजूदा इमेजिंग प्रणाली के लिए जोड़ा. अपने स्थानीय भौतिकी विभाग अक्सर करने के लिए एक व्यावहारिक परिचय प्रदान करने के लिए तैयार किसी को होगा हार्डवेयर हम केवल एक सामान्य गाइड के रूप में प्रयोग किया जाता है की एक सूची उपलब्ध कराई है. सुरक्षित रूप से मुक्त बीम लेज़रों के साथ काम कर रहा है.स्थिरीकरण और सी. के समय चूक इमेजिंग के लिए वैकल्पिक तरीकों एलिगेंस हाल ही में वर्णित किया गया है. 14
समस्या निवारण
सबसे कठिन और महत्वपूर्ण कदम केन्द्रित विस्तार खुर्दबीन के ऑप्टिकल अक्ष बीम के संरेखण है. एक बार जब आप बीम केंद्रित और गलीली लेंस तुम कठिन काम करने के लिए गठबंधन से पहले केंद्र को अंतिम संरेखण के लिए स्टीयरिंग दर्पण का उपयोग करना चाहिए खुर्दबीन ऑप्टिकल अक्ष के उम 5 के भीतर के माध्यम से विस्तार किया है. स्टीयरिंग दर्पण के अत्यधिक उपयोग के लिए खुर्दबीन के लिए बीम संरेखित बंद बीम के माध्यम से यह कदम होगा अक्षविस्तारक अत्यधिक सावधानी का उपयोग आप उचित एन डी फिल्टर के साथ लेजर बीम attenuate और एक चिंतनशील लक्ष्य (सामने की सतह दर्पण) पर सीधे लेजर बीम प्रोफ़ाइल देख सकते हैं . तुम धीरे कुहनी से हलका धक्का देखने के 60x उद्देश्य क्षेत्र में ठीक बीम केंद्र माइक्रोस्कोप (अगर यह ऊपर / नीचे रेंज आप रेल ऊंचाई को समायोजित करने के लिए की जरूरत में केंद्रित नहीं कर सकते हैं कर सकते हैं). किरण प्रोफ़ाइल करने के लिए ठीक खुर्दबीन ऑप्टिकल अक्ष संरेखित करने के लिए एक केंद्रित बीम है कि परिपत्र है और संतुलित "flares" दे इस्तेमाल किया जा सकता है. एक असममित भड़क एक संकेत है कि खुर्दबीन अक्ष पूरी तरह से (या रेल स्तर नहीं है) गठबंधन नहीं है. अंत में, आप L3 समायोजित और एक भी और सममित और बीम के विस्तार और संकुचन देखने चाहिए. खुर्दबीन ठीक लक्ष्य की सतह पर फोकस तब समायोजित L3 छोटी हाजिर करने के लिए लेजर बीम ध्यान केंद्रित. अब आप पाते हैं कि लेजर बीम के केंद्र उम 5 भीतर है जब LSCM या सीसीडी प्रणाली के माध्यम से imaged और पृथक हाजिर भीतर हैजेड ध्यान के 1um.
यदि आप पाते हैं आप "उड़ाने" कर रहे हैं कीड़े या लगातार बड़े cavitation बुलबुले पैदा axons आपकी समस्या को सबसे अधिक संभावना पृथक लेजर के ठीक संरेखण में कटौती. सुनिश्चित करें कि कम से कम (<500nm) पृथक जगह जेड (L3 लेंस के साथ अभिसरण समायोजित) ध्यान केंद्रित करने के लिए और XY प्रत्ययी हाजिर (पिछले kinematically घुड़सवार दर्पण के साथ समायोजित) स्थानीयकृत है.
Axons की सतह के लिए करीब लक्ष्यीकरण कम लेसर शक्ति की आवश्यकता होगी. इसी तरह, छोटे जानवरों (L1 और L2) axotomy के लिए कम लेजर शक्ति वयस्कों में एक ही axons लक्षित करने के लिए तुलना की आवश्यकता होगी.
यदि आपके जंगली प्रकार axons पुनर्जन्म या नहीं axons ब्लीच आप लेजर इमेजिंग शक्ति को कम करने या कम नमूना दर के प्रयास करना चाहिए. यदि आपके कीड़े मर जाते हैं या बन रोगीवत चरणों में 1% प्रतिशत agarose को कम करने की कोशिश करो. जब प्रति उच्च का उपयोग सुनिश्चित करें कि आप बढ़ते कीड़े के बाद coverslip नहीं बढ़ रहे हैं के रूप में इस बार उन्हें मरने के लिए कारण होगाcentage agarose और microspheres.
यदि आपके कीड़े फट या एक समय चूक सत्र के दौरान मरने की वजह से है: 1. प्रतिशत agarose बहुत अधिक है. 2. पृथक लेजर द्वारा छल्ली नुकसान पहुंचा. 3. Coverslip के बढ़ते के बाद आंदोलन. यदि छल्ली को नुकसान गलती है, यह केवल कि पृथक लेजर के साथ लक्षित किया गया है घुड़सवार कीड़े को प्रभावित करेगा.
यदि आपके कीड़ा एक समय चूक सत्र के दौरान बहुत ज्यादा चलता चरणों में 0.5% प्रतिशत agarose बढ़ाने का प्रयास करें. स्वस्थ कीड़े में स्वस्थ axons हमेशा से रहे हैं "" सक्रिय है और प्रतिदीप्ति का एक सुसंगत स्तर प्रदर्शित. यदि आप प्रतिदीप्ति या गतिविधि में अचानक कमी देखते कीड़ा मर या मर चुका है. एकाधिक मनके या खंडित axons एक मरते हुए या मृत कीड़ा की एक निश्चित संकेत हैं.
यदि आप मुसीबत ध्यान केंद्रित करने में पूरे समय चूक सत्र के दौरान अपने axons रखने है वहाँ कई अलग अलग समस्याओं का हो सकता है. इमेजिंग द्वारा पहले 10 घंटे पर अपने चरण बहाव एक गिलास स्लाइड पर एक आभ्यांतरिक नमूने की जांचरु. एक microns कुछ बहाव थर्मल अस्थिरता के कारण हो सकता है, लेकिन अधिक से अधिक 5 उम शायद अपने खुर्दबीन के साथ यांत्रिक मुद्दों के कारण. बढ़ते के साथ कोई समस्या अधिक आम है. चलो अपने घुड़सवार कीड़े 30 मिनट के लिए अपने खुर्दबीन मंच के साथ संतुलित करना से पहले अपने समय व्यतीत हो शुरू. जाँच करें कि आपके वेसिलीन सील लीक अपना समय व्यतीत हो जाने के सत्र के दौरान विकसित नहीं था.
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन, तंत्रिका विज्ञान के लिए McKnight बंदोबस्ती कोष, क्रिस्टोफर और दाना रीव फाउंडेशन और Amerisure चैरिटेबल फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| 535 nm Laser | Crylas | FDSS532Q3 | (TEEM, Crystal, and CRC also offer comparable lasers) |
| All optics and hardware | (Thor offers comparable optics and hardware) | ||
| SUPREMA Optical Mount, 1.0-in diameter | Newport | SS100-F2KN | 2 |
| 1″ diameter post, 1″ height | Newport | PS-1 | 1 |
| 1″ diameter post fork | Newport | PS-F | 1 |
| Achromatic Zero-Order Wavel Plate, ½ Wave Retardation, 400-700nm | Newport | 10RP52-1 | 1 |
| Rotation Stage, 1″ Aperature | Newport | RSP-1T | 1 |
| 1″ diameter post, 1″ height | Newport | PS-1 | 1 |
| 1″ diameter post fork | Newport | PS-F | 1 |
| Glan-Laser Calcite Polarizer, 430-700nm | Newport | 10GL08AR.14 | 1 |
| Polarizer Rotation Mount | Newport | RM25A | 1 |
| ¼” spacer for 1″ diameter post | Newport | PS-0.25 | 1 |
| ½” height, 1″diameter post | Newport | PS-0.5 | 1 |
| Fork, 1″ diameter post | Newport | PS-F | 1 |
| Beam Dump | Newport | PL15 | 1 |
| Microscope Objective Lens Mount | Newport | LH-OBJ1 | 1 |
| 1″ diameter post, 1″ height | Newport | PS-1 | 1 |
| 1″ diameter post fork | Newport | PS-F | 1 |
| High-Energy Nd:YAG Laser Mirror, 25.4 mm Diameter, 45°, 532 nm | Newport | 10Q20HE.2 | 4 |
| SUPREMA Optical Mount, 1.0 inch diameter, clearance mounting hole | Newport | SN100C-F | 2 |
| High Precision Knob Adjustment Screw, 12.7mm travel, 100TPI | Newport | AJS100-0.5K | 4 |
| Thread adaptor, ¼-20 male, 8-32 female | Newport | SS-1-B | 2 |
| Rod Clamp for 1.5 inch diameter rod | Newport | 340-RC | 2 |
| Rod, 14 inch (35.5 cm) tall | Newport | 40 | 1 |
| Rail carrier for X26, square 40mm length | Newport | CN26-40 | 4 |
| Steel Rail, 384mm (15″) length | Newport | X26-384 | 1 |
| Rod Platform for 1.5 inch diameter rod | Newport | 300-P | 2 |
| Rod, 14 inch (35.5 cm) tall | Newport | 40 | 2 |
| Plano-Concave Lens, 12.7mm diameter, -25mm EFL, 430-700nm | Newport | KPC025AR.14 | 2 |
| Plano-Convex Lens, 25.4mm diameter, 50.2mm EFL, 430-700nm | Newport | KPX082AR.14 | 1 |
| Plano-Convex Lens, 25.4mm diameter, 62.9mm EFL, 430-700nm | Newport | KPX085AR.14 | 1 |
| Fixed Lens Mount, 0.5″ diameter, 1.0″ Axis height | Newport | LH-0.5 | 2 |
| Fixed Lens Mount, 1.0″ diameter, 1.0″ Axis height | Newport | LH-1 | 2 |
| Microspheres 0.1um | Polysciences | 00876 | |
| Agarose | RPI | A20090 | EEO matters |
| Muscimol | Sigma | M1523 |
Riferimenti
- Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway. Science. 323, 802-806 (2009).
- Steinmeyer, J. D. Construction of a femtosecond laser microsurgery system. Nature protocols. 5, 395-407 (2010).
- Wu, Z. Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching. Proc Natl Acad. 104, 15132-15137 (2007).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nature protocols. 5, 1888-1902 (2010).
- Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. J. Microsc. 234, 1-8 (2009).
- Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Physical review letters. 99, 158104-158104 (2007).
- Venugopalan, V., Guerra, A., Nahen, K., Vogel, A. Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation. Physical review letters. 88, 078103-078103 (2002).
- Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans. Opt Express. 16, 5963-5963 (2008).
- O’Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (24), e1129-e1129 (2009).
- Tsai, P. S. Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 90-99 (2009).
- Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30-30 (2006).
- Shen, N. Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor. Mech. Chem. Biosyst. 2, 17-25 (2005).
- Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Opt. Express. 16, 9884-9894 (2008).
- Rohde, C. B., Yanik, M. F. Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates. Nat. Commun. 2, 271-271 (2011).
