Mycobacteria의 가능성을 측정하는 기능 전체 혈액 분석은 리포터 - 진 BCG 또는 M. TB (BCG 태그 사용 럭스 / M. TB 럭스)
Summary
우리는 mycobacteria의 열거에 대한 대안적인 접근 방식을 설명<em> 체외에서</em기자 – 유전자를 사용하여>는 대신 식민지 – 형성 단위 (CFU)의 mycobacteria 태그. 생물의 "생존"뿐만 아니라 호스트 반응 마커가 결핵의 맥락에서 호스트 / 병원체 상호 작용 연구를위한 저비용, 다목적 및 기능 시스템을 제공하는 동시에 측정됩니다.
Abstract
기능성 assays 오래 주어진 백신 immunogenicity의 측정에 중요한 역할을했습니다. 이것은 통상 혈청 bactericidal titers으로 표시됩니다. 어린 시절 백신에 대한 응답으로 혈청 bactericidal titers의 연구는 일상적인 사용에 우리가 보호 면역 반응과 같은 컷 오프에 대한 수준을 개발하고 차단 확인할 수있게했습니다. 그런 assays는 그러한 TB 백신으로 효과기 T 세포 응답의 형태로 주로 세포 매개 면역을 유발 백신의 일상적인 평가에 앞으로 이동되지 않았습니다. 동물 모델에서 특정 백신 후보의 성능은 정기적으로 표준 bactericidal assays에서 평가되며, 현재의 모든 소설 TB – 백신 후보는 1 인체에 실험을 위상하기 전에 자신의 평가에서이 단계를 받게되었습니다. immunogenicity 따라서 소설 안티 – TB 백신의 보호 효능 가능성의 평가는 이상적으로 bactericidal assays의 측정을 포함하여, 지금은 인간의 모델과 유사한 단계 현명한 평가를 받아야한다.
그들이 잠재적으로 유망한 백신 후보를 화면에 적용할 어디 결핵 백신 연구의 맥락에서 Bactericidal assays은 이미 잘, 동물 모델에 설립되었습니다. immunogenicity의 읽기 밖의 주요 등 다양한 장기의 기능에 세균 부하 감소. 그러나, 그러한 assays 데이트 소설 안티 – 결핵 백신에 대한 임상 실험에 포함되지 않았습니다.
인간의 macrophages 내부 mycobacteria의 살인으로 이어지는 정확한 메커니즘에 대한 불확실성이 여전히 있지만, mycobacteria과 macrophages 및 T 세포의 상호 작용은 명확하게 필요합니다. 이 문서에서 설명하는 분석들은 상대적으로 개인의 기여에 대한 가정을하지 않고 전체 피에 다른 모든 세포와 체액성 요소와 같은 주요 세포 구성 요소의 연구를 가능하게 bactericidal assays의 소설 세대를 나타냅니다. 우리의 그룹에 의해 설명하는 분석은 전체 혈액의 작은 볼륨을 사용하여 이미 TB – 지방병 설정에서 성인과 어린이의 연구에 채용되었습니다. 우리는 BCG 백신의 immunogenicity를 볼 HIV 양성 환자에서 mycobacteria의 성장뿐만 아니라 체외에서 mycobacterial 생존에 방지 retroviral 요법과 비타민 D의 효과를 증가하고있다. 여기서 우리는 방법론을 요약하고이 비교적 간단하고 저렴한 비용 및 현장 친화적인 모델을 사용하여 우리의 재현성 데이터를 제시한다.
참고 : 정의 / 약어
BCG 럭스 = M. bovis BCG, 몬트리올 변형은 mycobacterial GroEL (hsp60) 발기인의 통제하에, 장염 harveyi에서 luxAB 유전자를 나르는 셔틀 플라스미드 pSMT1로 바꾸었다.
CFU =의 콜로니 형성 단위 (mycobacterial 생존의 측정).
Protocol
Discussion
그들이 잠재적으로 유망한 백신 후보를 화면에 적용할 어디 결핵 백신 연구의 맥락에서 Bactericidal assays 잘, 동물 모델에 설립되었습니다. immunogenicity의 읽기 밖의 주요 등 다양한 장기의 기능에 세균 부하 감소.
인간 bactericidal assays의 첫 번째 세대 M. 감염, 혼자 macrophages을 사용하여 설계되었다 결핵. CFU 3 주 최소 시간이 지나면 mycobacterial 생존의 읽기 밖의 주요 ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 Wellcome 트러스트에서 비테 Kampmann (056608, GRO77273) 개인 장학금에 의해 투자되었다.
Materials
| Reagent | Company | Cat No |
| BCG lux | Various | n/a |
| Middlebrook 7H11 agar | Becton Dickinson | 283810 |
| Middlebrook 7H9 broth | BD Biosciences | 271310 (500g) |
| Middlebrook ADC enrichment | BD Biosciences | 212352 |
| Middlebrook OADC supplement | Becton Dickinson | 212240 |
| Tween 80 | Sigma Aldrich | 274364 |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5150 |
| Hygromycin B | Roche | 10843555001 (20ml) |
| N-decyl aldehyde | Sigma | D7384-100G |
| Ethanol (>99.7%) | VWR | 101077 |
| Sterile PBS | In House | n/a |
| RPMI-1640 with L-Glutamine, 25mM HEPES | Sigma | R0883 |
| Sterile distilled Water | In House | n/a |
| Equipment | ||
| Tube luminometer (injectable port mandatory) | Berthold AutoLumat LB953 or single-tube luminometer Sirius | |
| Luminometer tubes, 12 x 75mm, pyrex rimless | Corning from VWR | 99445-12 |
| Erlenmeyer flasks with vented caps, sterile polycarbonate 250ml | Corning via Fisher Scientific | 2150329 |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes (preservative-free heparin) | BD | 367676 |
| 50ml Falcon tubes, conical | BD | 352077 |
| 7ml Sterilin specimen polypropylene bijou tubes | VWR | 99445-12 |
| Sterilin Universal containers (30 ml) | Laboratory Analysis LTD | 128C |
| Glass beads 2mm diameter | SigmaAldrich | Z143928 |
| 10ml pipettes and pipette boy | any | |
| 1000μl and 200μl pipettes and filter tips | any | |
| General laboratory equipment: | ||
| Class II safety cabinet cabinet | ||
| Refrigerator (4°C) | ||
| Centrifuge | ||
| Rocking shaker platform (1800) to mix tubes | ||
| Orbital Shaker incubator set at 37°C for growing up bacterial cultures | ||
Riferimenti
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