Um Ensaio de sangue Funcional inteiro para medir a viabilidade de micobactérias, utilizando-Reporter Gene Tagged BCG ou M. Tb (BCG Lux / M. Tb Lux)

Summary

Descrevemos uma abordagem alternativa para a enumeração de micobactérias<em> In vitro</em>, Que usa repórter gene-tagged micobactérias em vez de unidades formadoras de colônia (UFC). "Survival" de organismos, bem como anfitrião-resposta marcadores são medidos simultaneamente, proporcionando um sistema de baixo custo, versátil e funcional para os estudos de host / patógeno interações no contexto da tuberculose.

Abstract

Ensaios funcionais há muito tempo desempenhou um papel fundamental na medição da imunogenicidade de uma vacina dada. Este é convencionalmente expressa como soro títulos bactericida. Estudos de soro títulos bactericida em resposta a vacinas infantis nos permitiram desenvolver e validar níveis de corte para respostas imunes protetoras e tal cut-offs estão em uso rotineiro. Sem tais ensaios foram levadas adiante na avaliação de rotina de vacinas que induzem principalmente a imunidade mediada por células em forma de respostas de células T efetoras, tais como vacinas contra a tuberculose. No modelo animal, o desempenho de um candidato a vacina dada é rotineiramente avaliada em ensaios padronizados bactericida, e todos os atuais romance TB vacina candidatos foram submetidos a esta etapa na sua avaliação antes da fase 1 de testes em humanos. A avaliação da imunogenicidade e, portanto, a probabilidade de eficácia protectora do romance de vacinas anti-TB deve idealmente submetidos a uma avaliação por etapas semelhantes nos modelos humanos agora, incluindo medidas em ensaios bactericida.

Ensaios bactericida no contexto da pesquisa vacina contra a tuberculose já estão bem estabelecidos em modelos animais, onde eles são aplicados a tela de vacinas candidatas potencialmente promissoras. Redução da carga bacteriana em várias funções órgãos como a principal leitura de imunogenicidade. No entanto, nenhum de tais ensaios foram incorporados ensaios clínicos para novos medicamentos anti-TB vacinas até o momento.

Embora ainda haja incerteza sobre os mecanismos exatos que levam à morte de micobactérias no interior dos macrófagos humanos, a interação de macrófagos e células T com micobactérias é claramente necessária. O ensaio descrito neste trabalho representa uma geração nova de ensaios bactericida que permite estudos de tal chave componentes celulares com todos os outros fatores celular e humoral presentes no sangue inteiro sem fazer suposições sobre sua contribuição relativa individual. O ensaio descrito pelo nosso grupo utiliza pequenos volumes de sangue total e já foi empregada em estudos com adultos e crianças em TB endêmica configurações. Nós mostramos imunogenicidade da vacina BCG, aumento do crescimento de micobactérias em pacientes HIV-positivos, bem como o efeito da terapia anti-retroviral e vitamina D sobre a sobrevivência de micobactérias in vitro. Aqui resumimos a metodologia e apresentar os nossos dados de reprodutibilidade usando este modelo relativamente simples, de baixo custo e de campo-friendly.

Nota: Definições / Abreviaturas

BCG lux = M. bovis BCG, cepa Montreal, transformada com pSMT1 shuttle plasmídeo carregando a genes de Vibrio harveyi luxAB, sob o controle do GroEL micobactérias (Hsp60) promotor.
UFC = Unidade Colony Forming (uma medida de viabilidade de micobactérias).

Protocol

1. Preparação de BCG estoque repórter lux micobactérias Crescer BCG lux (M. bovis BCG cepa Montreal transformado com o plasmídeo pSMT1 shuttle) com agitação a 200 rpm até meados de logarítmica fase em Middlebrook 7H9 caldo contendo 0,2% de glicerol, 0,05% entre 80 e 10% de enriquecimento ADC. Prepare 1 ml de uma diluição de 1:10 de BCG cultura lux em PBS estéril em um tubo de luminômetro (900μl de PBS + 100μl BCG cultura lux) em duplicata. …

Discussion

Ensaios bactericida no contexto da pesquisa vacina contra a tuberculose estão bem estabelecidos em modelos animais, onde são aplicados para a tela vacinas candidatas potencialmente promissoras. Redução da carga bacteriana em várias funções órgãos como a principal leitura de imunogenicidade.

A primeira geração de humanos ensaios bactericida foram projetados usando macrófagos sozinho, infectados com M. tuberculose. CFU serviu como a principal leitura de sobrevivência de m…

Materials

Reagent	Company	Cat No
BCG lux	Various	n/a
Middlebrook 7H11 agar	Becton Dickinson	283810
Middlebrook 7H9 broth	BD Biosciences	271310 (500g)
Middlebrook ADC enrichment	BD Biosciences	212352
Middlebrook OADC supplement	Becton Dickinson	212240
Tween 80	Sigma Aldrich	274364
Glycerol	Sigma Aldrich	G5150
Hygromycin B	Roche	10843555001 (20ml)
N-decyl aldehyde	Sigma	D7384-100G
Ethanol (>99.7%)	VWR	101077
Sterile PBS	In House	n/a
RPMI-1640 with L-Glutamine, 25mM HEPES	Sigma	R0883
Sterile distilled Water	In House	n/a
Equipment
Tube luminometer (injectable port mandatory)	Berthold AutoLumat LB953 or single-tube luminometer Sirius
Luminometer tubes, 12 x 75mm, pyrex rimless	Corning from VWR	99445-12
Erlenmeyer flasks with vented caps, sterile polycarbonate 250ml	Corning via Fisher Scientific	2150329
BD Vacutainer Blood Collection Tubes (preservative-free heparin)	BD	367676
50ml Falcon tubes, conical	BD	352077
7ml Sterilin specimen polypropylene bijou tubes	VWR	99445-12
Sterilin Universal containers (30 ml)	Laboratory Analysis LTD	128C
Glass beads 2mm diameter	SigmaAldrich	Z143928
10ml pipettes and pipette boy	any
1000μl and 200μl pipettes and filter tips	any
General laboratory equipment:
Class II safety cabinet cabinet
Refrigerator (4°C)
Centrifuge
Rocking shaker platform (1800) to mix tubes
Orbital Shaker incubator set at 37°C for growing up bacterial cultures